Pestisida nduweni peran penting kanggo ngatasi kekurangan pangan global lan nglawan penyakit manungsa sing ditularake vektor. Nanging, masalah resistensi pestisida sing saya tambah akeh mbutuhake panemuan senyawa anyar sing nargetake target sing kurang digunakake. Saluran potensial reseptor transien serangga (TRPV)—Nanzhong (Nan) lan ora aktif (Iav)—bisa mbentuk saluran heterolog (Nan-Iav) lan terlokalisasi menyang organ mekanosensori sing ngantara geotropisme, pangrungu, lan propriosepsi ing serangga. Sawetara pestisida, kayata aphidopyrrolidone (AP), nargetake Nan-Iav liwat mekanisme sing ora dingerteni. AP efektif nglawan serangga sing nyedhot tindik (hemipteran), nyegah mangan kanthi ngganggu fungsi filamen. AP mung bisa kaiket karo Nan, nanging mung Nan-Iav sing bisa berinteraksi karo agonis, kalebu nikotinamida endogen (NAM), saengga nuduhake aktivitas saluran. Senadyan potensi Nan-Iav minangka target insektisida, sithik sing dingerteni babagan perakitan saluran, situs pengikatan peraturan, lan regulasi sing gumantung karo Ca2+, sing ngalangi pangembangan insektisida luwih lanjut. Ing panliten iki, mikroskop krio-elektron digunakake kanggo nemtokake struktur Nan-Iav ing serangga Hemiptera ing kahanan bebas calmodulin-ligan, uga karo AP lan NAM ing wates domain sitoplasma pengulangan ankyrin (ARD). Sing nggumunake, kita nemokake yen protein Nan dhewe bisa mbentuk pentamer, sing distabilisasi dening interaksi ARD sing dimediasi AP. Panliten iki mbukak interaksi molekuler antarane insektisida lan agonis lan Nan-Iav, sing nyoroti pentinge ARD ing fungsi lan perakitan saluran, lan njelajah mekanisme regulasi Ca2+.
Kanthi latar mburi owah-owahan iklim global sing saya parah, keamanan pangan global sing saya rusak minangka salah sawijining tantangan utama ing abad kaping 21, kanthi akibat sing terus-terusan kanggo masyarakat.1,2Laporan Kahanan Keamanan Pangan lan Nutrisi ing Donya 2023 (SOFI) saka Organisasi Kesehatan Dunia ngira-ngira yen kira-kira 2,33 milyar wong ing saindenging jagad nandhang sangsara saka kerawanan pangan moderat nganti parah, masalah sing wis suwe ana.3,4Sayange, kira-kira 20% nganti 30% utawa luwih saka panenan tanduran ilang saben taun amarga hama lan patogen, lan pemanasan global diarepake bakal nambah resistensi hama lan kerentanan tanduran.4,5,6,7,8Pangembangan pestisida iku penting banget ora mung kanggo nglindhungi tanduran saka hama lan nyuda panyebaran patogen sing ditularake vektor, nanging uga kanggo nglawan penyakit manungsa sing ditularake vektor kayata demam berdarah, malaria, lan penyakit Chagas, sing saya tambah tahan marang pestisida.5,9,10,11
Saka target utama insektisida neurotoksik, saluran TRPV heterotetramerik Nanchung (Nan)-Inaktif (Iav) minangka kelas target insektisida sing ditemokake ing dasawarsa pungkasan, kalebu insektisida sing kasedhiya sacara komersial kayata imidakloprid lan piraclostrobin.12, 13, 14Insektisida semisintetik aphidopyrrolifen (AP) minangka produk sing nembe dikembangake lan dikomersialake sing komponen utamane yaiku insektisida aktif Inscalis®, sing ngiket AP ing tingkat aktivitas subnanomolar.15AP nuduhake keracunan akut sing endhek kanggo penyerbuk, serangga sing migunani, lan organisme non-target liyane, lan nalika digunakake miturut pandhuan label, bisa nyuda tekanan resistensi marang insektisida liyane.16, 17, 18Nan lan Iav kasebar sacara wiyar ing spesies serangga, mung diekspresikan bebarengan ing neuron reseptor regangan kordal antena lan anggota awak, lan penting kanggo pangrungon, persepsi gravitasi, lan proprioseptif.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid, lan piraclostrobin ngrangsang kompleks Nan-Iav liwat mekanisme unik, sing pungkasane ngalangi transduksi sinyal proprioseptif.13,16,23Ing serangga nyedhot nusuk (hemipteran) kayata kutu daun lan laler putih, ilang proprioseptif ngrusak kemampuan mangane, sing pungkasane nyebabake pati.13,24Menariknya, AP nuduhake afinitas sing dhuwur kanggo kompleks Nan-Iav lan afinitas sing kurang kanggo Nan wae. Ikatan AP karo Nan-Iav nyebabake arus listrik, nanging ikatan karo Nan wae ora ngrangsang aktivitas saluran. Iav dhewe ora ikatan karo AP babar pisan.16Iki nuduhake yen Nan lan Iav bisa kaiket kanggo mbentuk kompleks saluran Nan-Iav sing beda (contone, kanthi rasio stoikiometrik sing beda utawa susunan sing beda ing rasio stoikiometrik sing padha) utawa AP bisa kaiket menyang pirang-pirang situs. Salajengipun, agonis nikotinamida alami (NAM) kaiket karo Drosophila Nan-Iav kanthi afinitas mikromolar, nuduhake efek sing padha karo kutu daun (AP) in vitro.16,25lan ngalangi reproduksi lan mangan kutu, sing pungkasane nyebabake pati25,26Data iki nuwuhake akeh pitakonan. Contone, isih durung jelas kepiye heterodimer Nan-Iav dibentuk, situs pengikatan endi sing digunakake kanggo modulasi molekul cilik, lan kepiye molekul cilik iki ngatur fungsi saluran kanthi nyuda proprioception. Salajengipun, alesan kenapa Nan dhewe ora aktif lan duwe afinitas sing kurang kanggo AP, dene heterodimer Nan-Iav aktif lan ngiket AP kanthi afinitas sing luwih dhuwur, isih durung jelas. Pungkasan, sithik sing dingerteni babagan regulasi fungsi Nan-Iav sing gumantung karo Ca2+ lan kepiye diintegrasi menyang proses sinyal neuronal.. 13,21
Ing panliten iki, kanthi nggabungake mikroskop krio-elektron, elektrofisiologi, lan teknik pengikatan radioligand, kita njlentrehake perakitan Nan-Iav lan mekanisme pengikatane karo regulator molekul cilik. Salajengipun, kita ndeteksi calmodulin (CaM) sing kaiket sacara konstitutif karo pentamer Nan sing distabilisasi Iav lan AP. Asil kasebut menehi wawasan penting babagan regulasi ion kalsium ing saluran, perakitan saluran, lan faktor sing nemtokake afinitas pengikatan ligan. Sing luwih penting, kita ngonfirmasi manawa ARD nduweni peran penting ing proses kasebut. Panliten kita babagan saluran serangga lengkap sing kaiket karo pestisida pertanian sing relevan27, 28, 29mbukak prospek kanggo pangembangan industri pestisida, ningkatake efektifitas lan spesifisitas pestisida, lan ngaktifake aplikasi senyawa sing ditarget TRPV menyang spesies liyane kanggo ngatasi keamanan pangan global lan panyebaran penyakit sing ditularake vektor.
Kita uga nemokake yen Nan-Iav diatur dening Ca2+, lan mekanisme regulasi kasebut dimediasi dening CaM sing kaiket sacara konstitutif. Sing penting, regulasi Nav sing gumantung karo Ca2+ iki beda banget karo mekanisme regulasi saluran ion liyane (kayata, saluran Na+ sing dijaga voltase lan saluran TRPV5/6)52,53,54,55,56,57Ing saluran Nav1.2, domain C-terminal CaM sacara heliks digandhengake karo domain C-terminal (CTD), lan Ca2+ nyebabake pengikatan domain N-terminal menyang bagean distal CTD.56Ing saluran TRPV5/6, domain C-terminal CaM kaiket karo CTH, lan Ca2+ ngindhuksi ekstensi munggah saka domain N-terminal menyang pori, saengga ngalangi permeabilitas kation.53,54Kita ngusulake model kanggo fungsi Nan-Iav-CaM sing diatur Ca2+ (Gambar 4h). Ing model iki, domain N-terminal CaM kanthi konstitutif kaiket karo domain C-terminal (CTH) Iav. Ing kahanan istirahat (konsentrasi [Ca2+] sing endhek), domain C-terminal CaM berinteraksi karo Nan, nyetabilake konformasi ARD lan kanthi mangkono ningkatake pambukaan saluran. Ikatan agonis/insektisida menyang saluran nyebabake pambukaan pori, sing nyebabake masuknya Ca2+. Ca2+ banjur kaiket karo CaM, nyebabake disosiasi domain C-terminal saka ARD Nan. Amarga pamblokiran ikatan CaM intine ngilangi efek inhibisi Ca2+, disosiasi iki modulasi mobilitas ARD, saengga nyebabake inhibisi utawa desensitisasi sing gumantung karo Ca2+. Pemulihan arus saluran sing cepet sawise elusi ion kalsium (Gambar 4g) nuduhake yen mekanisme iki nggampangake respon cepet marang sinyal neuronal sing dimediasi Ca2+. Salajengipun, wilayah C-terminal Iav, ingkang taksih dereng dipunmangertosi kanthi sae, sampun dipunlaporaken gadhah peran sanès ing panargetan saluran lan regulasi sapunika.21
Pungkasan, panliten kita nampilake struktur resolusi dhuwur saka kompleks saluran TRP insektisida-insektisida sing penting kanggo pertanian—penemuan sing sadurunge ora dingerteni dening kita. Khususé, kita njlèntrèhaké struktur lan fungsi saluran serangga ing sel manungsa (HEK293S GnTi–) tinimbang ing sel serangga. Ngadhepi resistensi insektisida sing saya tambah lan tekanan sing terus-terusan marang keamanan pangan lan patogen, karya kita nyedhiyakake informasi penting sing bakal nggampangake pangembangan insektisida anyar kanggo kepentingan kesehatan manungsa lan keamanan pangan global. Panliten wis nuduhake manawa insektisida kayata AP efektif nglawan sawetara hama nalika digunakake miturut pandhuan label lan duwe keracunan akut sing sithik kanggo penyerbuk sing migunani, sing nuduhake keamanan lingkungan.13,16Salajengipun, uji coba sawetara turunan AP ing lemut nuduhake yen pungkasane lemut bakal kelangan kemampuane kanggo mabur. Ngerteni kepiye senyawa modulasi iki kaiket karo Nan-Iav bakal nggampangake modifikasi senyawa sing wis ana utawa pangembangan senyawa anyar kanggo luwih efektif lantepatpengendalian hama. Panliten kita nduduhake manawa antarmuka ARD Nan-Iav penting banget ora mung kanggo ngatur aktivitas senyawa endogen, pestisida, lan Ca2+-CaM, nanging uga kanggo perakitan saluran. Kita saranake manawa ngganggu perakitan heterodimer nganggo molekul cilik bisa dadi pendekatan sing unik lan janjeni kanggo ngembangake inhibitor saluran ion.
Saka wolung gen ortolog, gen lengkap saka kumbang coklat (Halyomorpha halys) Nanchung lan Inactive dipilih, sing nuduhake stabilitas sing apik banget ing deterjen. Gen sing disintesis dioptimalake kodon kanggo ekspresi manungsa lan diklon menyang vektor pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) nggunakake situs restriksi XhoI lan EcoRI. Iki njamin yen klon kasebut ana ing pigura karo tag C-terminal GFP-FLAG-10xHis lan mCherry-FLAG-10xHis, sing dibelah dening protease HRC-3C (PPX), sing ngidini independenekspresiPrimer sing digunakake kanggo ngkloning Nanchung lan Inactive menyang vektor pBacMam yaiku kaya ing ngisor iki:
Gambar mikroskopis partikel individu dijupuk nganggo mikroskop elektron transmisi (FEI) Titan Krios G2 sing dilengkapi kamera K3 lan filter energi Gatan BioQuantum. Mikroskop iki dioperasikake ing 300 keV, kanthi setelan energi 20 eV, ukuran piksel sampel 1,08 Å/piksel (pembesaran nominal 81.000x), lan gradien defokus wiwit saka -0,8 nganti -2,2 μm. Rekaman video ditindakake ing 40 pigura per detik nggunakake mikroskop Latitude S (Gatan) kanthi tingkat dosis nominal 25 e–px−1 s−1, wektu paparan 2,4 s, lan dosis total kira-kira 60 e–Å−2.
Koreksi gerakan sing diinduksi sinar lan bobot dosis ditindakake ing film nggunakake MotionCor2 ing RELION 4.061. Estimasi parameter fungsi transfer kontras (CTF) ditindakake ing cryoSPARC nggunakake metode estimasi CTF berbasis patch62. Fotomikrograf kanthi resolusi pas CTF ≥4 Å ora kalebu ing analisis sabanjure. Biasane, subset 500-1000 fotomikrograf digunakake kanggo pemilihan titik ing cryoSPARC, diikuti karo sawetara babak klasifikasi 2D sawise nyaring kanggo entuk gambar referensi sing jelas kanggo pemilihan partikel berbasis template. Partikel banjur diekstrak nggunakake kothak watesan 64-piksel lan binning 4-fold. Sawetara babak klasifikasi 2D ditindakake kanggo mbusak kategori partikel sing ora dikarepake. Model 3D awal direkonstruksi nggunakake rekonstruksi ab initio lan dimurnike nggunakake penyempurnaan non-seragam ing cryoSPARC. Klasifikasi 3D ditindakake ing cryoSPARC utawa RELION adhedhasar heterogenitas ARD. Ora ana heterogenitas domain membran sing signifikan sing diamati. Partikel-partikel kasebut diolah nganggo metode C1 lan C2; partikel kanthi resolusi C2 sing luwih dhuwur dianggep simetris gegayutan karo C2 lan diimpor menyang RELION kanggo penyempurnaan Bayesian. Partikel-partikel kasebut banjur ditransfer bali menyang cryoSPARC kanggo penyempurnaan lokal lan non-seragam pungkasan. Resolusi pungkasan lan cacah partikel dituduhake ing Tabel 1.
Nalika ngolah pentamer Nan+AP, kita njelajah macem-macem metode kanggo ningkatake resolusi domain membran (utamane wilayah pori), kayata pengurangan sinyal lan masking TMD. Nanging, upaya kasebut ora kasil amarga gangguan sing potensial ekstrem ing wilayah pori lan heterogenitas sakabèhé TMD. Resolusi pungkasan diitung nggunakake topeng sing digawe kanthi otomatis dening metode pangolahan non-seragam ing cryoSPARC, utamane nargetake wilayah ARD. Iki entuk resolusi sing luwih dhuwur tinimbang domain membran (utamane wilayah VSLD).
Model de novo awal saka bentuk apo saka bug Nanchung lan Inactive pisanan digawe nggunakake Coot63, lan model bug Nan lan Iav digawe nggunakake AlphaFold264 kanggo ngenali wilayah kanthi kapercayan sing kurang. Pemodelan Calmodulin adhedhasar kecocokan awak kaku saka model pengikat Ca2+ lan bebas Ca2+ ing aksesi PDB 4JPZ56 lan 1CFD65. Model kasebut diolah nggunakake penyempurnaan bola kanggo njamin stereokimia sing bener lan geometri sing apik. Fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamina, lan fosfatidilserin banjur dimodelake minangka kapadhetan lipid sing ditetepake kanthi apik, lan ligan NAM lan AP diselehake ing kapadhetan sing cocog ing sambungan sing rapet. File kendala digawe saka string SMILES saka isoform nggunakake eLBOW ing PHENIX66. Pungkasan, model kasebut diolah ing ruang nyata ing PHENIX nggunakake telusuran grid lokal lan minimalisasi global kanthi kendala struktur sekunder. Server MolProbity digunakake kanggo penyempurnaan model lan analisis struktural, lan ilustrasi ditindakake nggunakake PyMOL lan UCSF Chimera X. Analisis apertur ditindakake nggunakake server HOLE,70 lan pemetaan konservasi urutan ditindakake nggunakake server Consurf.71
Analisis statistik ditindakake nggunakake Igor Pro 6.2, Excel Office 365, lan GraphPad Prism 7.0. Kabeh data kuantitatif ditampilake minangka rata-rata ± kesalahan standar (SEM). Uji-t Student (loro-sisi, ora dipasangake) digunakake kanggo mbandhingake rong klompok. Analisis varians siji arah (ANOVA) banjur uji post hoc Dunnett digunakake kanggo mbandhingake pirang-pirang klompok. *P< 0.05, **P< 0.01, lan ***P< 0,001 dianggep signifikan sacara statistik gumantung saka distribusi data. Nilai Kd, Ki, lan interval kapercayan 95% asimetris diitung nggunakake GraphPad Prism 10.
Kanggo rincian luwih lengkap babagan metodologi panliten, delengen Ringkesan Laporan Portofolio Alam sing ana gandhengane ing artikel iki.
Model awal dibangun nggunakake model calmodulin saka basis data PDB 4JPZ lan 1CFD. Koordinat kasebut wis disimpen ing Protein Data Bank (PDB) kanthi nomer aksesi 9NVN (Nan-Iav-CaM tanpa ligan), 9NVO (Nan-Iav-CaM kaiket karo nikotinamida), 9NVP (Nan-Iav-CaM kaiket karo nikotinamida lan EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM kaiket karo aphenidolpyrrolline lan kalsium), 9NVR (Nan-Iav-CaM kaiket karo aphenidolpyrrolline lan EDTA), lan 9NVS (Nan pentamer kaiket karo aphenidolpyrrolline). Gambar mikroskop krio-elektron sing cocog disimpen ing Database Mikroskopi Elektron (EMDB) kanthi nomer aksesi ing ngisor iki: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM tanpa ligan), EMD-49845 (kompleks Nan-Iav-CaM karo nikotinamida), EMD-49846 (kompleks Nan-Iav-CaM karo nikotinamida lan EDTA), EMD-49847 (kompleks Nan-Iav-CaM karo aphidopirolina lan kalsium), EMD-49848 (kompleks Nan-Iav-CaM karo aphidopirolina lan EDTA), lan EMD-49849 (kompleks Nan pentamer karo aphidopirolina). Data mentah kanggo analisis fungsional diwenehake ing makalah iki.
Wektu kiriman: 28 Januari 2026