Obat anthelmintik N,N-diethyl-m-toluamideDEET) wis dilapurake kanggo nyandhet AChE (acetylcholinesterase) lan nduweni sifat karsinogenik potensial amarga vascularization sing berlebihan. Ing makalah iki, kita nuduhake yen DEET khusus ngrangsang sel endothelial sing ningkatake angiogenesis, saéngga nambah pertumbuhan tumor. DEET ngaktifake proses seluler sing nyebabake angiogenesis, kalebu proliferasi, migrasi, lan adhesi. Iki digandhengake karo tambah produksi NO lan ekspresi VEGF ing sel endothelial. Silencing M3 utawa nggunakake inhibitor M3 farmakologis ngilangi kabeh efek kasebut, nuduhake yen DEET-induced angiogenesis sensitif M3. Eksperimen sing nglibatake sinyal kalsium ing sel endothelial lan HEK sing overexpressing reseptor M3, uga studi ikatan lan docking, nuduhake yen DEET tumindak minangka modulator allosteric saka reseptor M3. Salajengipun, DEET nyandhet AChE, saéngga nambah bioavailabilitas asetilkolin lan ikatan karo reseptor M3, lan nambah efek proangiogenik liwat regulasi allosterik.
EC primer diisolasi saka aorta tikus Swiss. Cara ekstraksi diadaptasi saka protokol Kobayashi 26 . Murine ECs dibudidayakan ing medium EBM-2 sing ditambah karo FBS sing ora aktif panas nganti 5% nganti kaping papat.
Efek saka rong konsentrasi DEET ing proliferasi HUVEC, U87MG, utawa BF16F10 dianalisis nggunakake CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Sedhela, 5,103 sel saben sumur diwutahake ing piring 96 sumur, diidini dipasang ing wayah wengi, banjur diobati nganggo DEET suwene 24 jam. Sawise ngilangi medium wutah, tambahake larutan pengikat pewarna menyang saben sumur microplate lan inkubasi sel ing suhu 37 ° C suwene 30 menit. Tingkat fluoresensi ditemtokake nggunakake maca microplate multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Jerman) sing dilengkapi saringan eksitasi 485 nm lan saringan emisi 530 nm.
HUVEC disemai pada 96 sumuran dengan kepadatan 104 sel per sumuran. Sel diobati karo DEET sajrone 24 jam. Viabilitas sel ditaksir kanthi nggunakake uji MTT colorimetric (Sigma-Aldrich, M5655). Nilai kapadhetan optik dipikolehi ing maca microplate multimode (Mithras LB940) kanthi dawa gelombang 570 nm.
Efek DEET diteliti nggunakake tes angiogenesis in vitro. Perawatan karo 10-8 M utawa 10-5 M DEET nambah pembentukan dawa kapiler ing HUVECs (Gambar 1a, b, bar putih). Dibandhingake karo klompok kontrol, perawatan karo konsentrasi DEET wiwit saka 10-14 nganti 10-5 M nuduhake yen dawa kapiler tekan dataran tinggi ing 10-8 M DEET (Tambahan Gambar S2). Ora ana prabédan sing signifikan ditemokake ing efek proangiogenik in vitro HUVEC sing diobati karo DEET ing kisaran konsentrasi 10-8 M lan 10-5 M.
Kanggo nemtokake efek DEET ing neovascularization, kita nindakake studi neovascularization in vivo. Sawise 14 dina, tikus sing disuntik karo sel endothelial sing dibudidayakake kanthi 10-8 M utawa 10-5 M DEET nuduhake peningkatan sing signifikan ing isi hemoglobin (Gambar 1c, bar putih).
Salajengipun, neovaskularisasi sing diakibatake DEET diteliti ing tikus-tikus sing duwe xenograft U87MG sing disuntikake saben dina (ip) karo DEET kanthi dosis sing dikenal kanggo ngindhuksi konsentrasi plasma 10-5 M, sing normal ing manungsa sing katon. ing 23. Tumor sing bisa dideteksi (yaiku tumor> 100 mm3) diamati 14 dina sawise injeksi sel U87MG menyang tikus. Ing dina 28, wutah tumor sacara signifikan ditingkatake ing tikus sing diobati DEET dibandhingake karo tikus kontrol (Gambar 1d, kotak). Salajengipun, pewarnaan CD31 tumor nuduhake yen DEET nambah area kapiler nanging ora kapadhetan microvessel. (Gambar 1e–g).
Kanggo nemtokake peran reseptor muscarinic ing proliferasi DETA-induced, 10-8 M utawa 10-5 M DETA ing ngarsane pFHHSiD (10-7 M, antagonis reseptor M3 selektif) digunakake. Perawatan saka HUVEC. pFHHSiD rampung ngalangi sifat proliferatif DETA ing kabeh konsentrasi (Tabel 1).
Ing kahanan kasebut, kita uga mriksa apa DEET bakal nambah dawa kapiler ing sel HUVEC. Kajaba iku, pFHHSiD nyegah dawa kapiler sing diakibatake DEET (Gambar 1a, b, bar abu-abu). Kajaba iku, eksperimen sing padha ditindakake kanthi M3 siRNA. Sanajan kontrol siRNA ora efektif kanggo ningkatake pembentukan kapiler, silencing saka reseptor muskarinik M3 ngilangi kemampuan DEET kanggo nambah dawa kapiler (Gambar 1a, b, bar ireng).
Salajengipun, loro 10-8 M utawa 10-5 M DEET-induced vascularization in vitro lan neovascularization in vivo rampung diblokir dening pFHHSiD (Fig. 1c, d, bunderan). Asil kasebut nuduhake yen DEET ningkatake angiogenesis liwat jalur sing sensitif marang antagonis reseptor M3 selektif utawa siRNA M3.
AChE minangka target molekul DEET. Obat-obatan kayata donepezil, sing tumindak minangka inhibitor AChE, bisa ngrangsang EC angiogenesis in vitro lan ing model iskemia hindlimb tikus14. Kita nguji efek saka rong konsentrasi DEET ing aktivitas enzim AChE ing HUVEC. Konsentrasi DEET kurang (10-8 M) lan dhuwur (10-5 M) nyuda aktivitas AChE endothelial dibandhingake karo kondisi kontrol (Gambar 2).
Kaloro konsentrasi DEET (10-8 M lan 10-5 M) nyuda aktivitas acetylcholinesterase ing HUVEC. BW284c51 (10-5 M) digunakake minangka kontrol kanggo inhibitor acetylcholinesterase. Asil dituduhake minangka persentase aktivitas AChE ing HUVEC sing diobati kanthi rong konsentrasi DEET dibandhingake karo sel sing diobati kendaraan. Nilai ditulis minangka rata-rata ± SEM saka enem eksperimen independen. *p <0.05 dibandhingake kontrol (Kruskal-Wallis lan Dunn sawetara tes comparison).
Nitric oxide (NO) melu proses angiogenik 33, mula, produksi NO ing HUVEC sing dirangsang DEET diteliti. Produksi NO endothelial sing diobati DEET tambah akeh dibandhingake karo sel kontrol, nanging mung entuk pinunjul ing dosis 10-8 M (Gambar 3c). Kanggo nemtokake owah-owahan molekul sing ngontrol produksi NO sing diakibatake DEET, ekspresi lan aktivasi eNOS dianalisis dening Western blotting. Sanajan perawatan DEET ora ngowahi ekspresi eNOS, kanthi signifikan ningkatake fosforilasi eNOS ing situs aktivasi (Ser-1177) nalika ngurangi situs inhibisi (Thr-495) dibandhingake karo sel sing ora diobati ing fosforilasi eNOS (Fig. 3d). Salajengipun, rasio eNOS fosforilasi ing situs aktivasi lan situs inhibisi diitung sawise normalake jumlah eNOS fosforilasi menyang jumlah total enzim. Rasio iki tambah akeh ing HUVEC sing diobati karo saben konsentrasi DEET dibandhingake karo sel sing ora diobati (Gambar 3d).
Pungkasan, ekspresi VEGF, salah sawijining faktor proangiogenik utama, dianalisis dening Western blotting. DEET nambah ekspresi VEGF kanthi signifikan, dene pFHHSiD ngalangi ekspresi iki.
Amarga efek DEET sensitif marang blokade farmakologis lan downregulation saka reseptor M3, kita nyoba hipotesis yen DEET bisa nambah sinyal kalsium. Kaget, DEET gagal nambah kalsium sitoplasma ing HUVEC (data ora ditampilake) lan HEK / M3 (Gambar 4a, b) kanggo loro konsentrasi sing digunakake.
Wektu kirim: Dec-30-2024