Obat anthelmintik N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) wis dilapurake bisa nyegah AChE (asetilkolinesterase) lan nduweni sipat karsinogenik potensial amarga vaskularisasi sing berlebihan. Ing makalah iki, kita nuduhake yen DEET khusus ngrangsang sel endotel sing ningkatake angiogenesis, saengga nambah pertumbuhan tumor. DEET ngaktifake proses seluler sing nyebabake angiogenesis, kalebu proliferasi, migrasi, lan adhesi. Iki ana gandhengane karo peningkatan produksi NO lan ekspresi VEGF ing sel endotel. Nyenyak M3 utawa nggunakake inhibitor M3 farmakologis ngilangi kabeh efek kasebut, sing nuduhake yen angiogenesis sing diinduksi DEET sensitif marang M3. Eksperimen sing nglibatake sinyal kalsium ing sel endotel lan HEK sing ngekspresikan reseptor M3 kanthi berlebihan, uga studi pengikatan lan docking, nuduhake yen DEET tumindak minangka modulator alosterik reseptor M3. Salajengipun, DEET nyegah AChE, saengga nambah bioavailabilitas asetilkolin lan pengikatan menyang reseptor M3, lan nambah efek proangiogenik liwat regulasi alosterik.
EC primer diisolasi saka aorta tikus Swiss. Cara ekstraksi iki diadaptasi saka protokol Kobayashi 26. EC Murine dikultur ing medium EBM-2 sing ditambah karo FBS sing ora diaktifake panas 5% nganti passage kaping papat.
Efek saka rong konsentrasi DEET marang proliferasi HUVEC, U87MG, utawa BF16F10 dianalisis nggunakake CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Secara ringkes, 5,103 sel saben sumur diubengi ing piring 96-sumur, diidini nempel sewengi, banjur diolah nganggo DEET sajrone 24 jam. Sawise mbusak media pertumbuhan, tambahake larutan pengikat pewarna menyang saben sumur mikroplate lan inkubasi sel ing suhu 37 °C sajrone 30 menit. Tingkat fluoresensi ditemtokake nggunakake pembaca mikroplate multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Jerman) sing dilengkapi filter eksitasi 485 nm lan filter emisi 530 nm.
HUVEC disebar ing piring 96-sumur kanthi kapadhetan 104 sel saben sumur. Sel diolah nganggo DEET sajrone 24 jam. Kelangsungan hidup sel ditaksir nggunakake uji MTT kolorimetri (Sigma-Aldrich, M5655). Nilai kapadhetan optik dipikolehi ing pembaca piring mikro multimode (Mithras LB940) kanthi dawa gelombang 570 nm.
Efek DEET ditliti nggunakake uji angiogenesis in vitro. Perawatan nganggo 10-8 M utawa 10-5 M DEET nambah pembentukan dawa kapiler ing HUVEC (Gambar 1a, b, garis putih). Dibandhingake karo klompok kontrol, perawatan nganggo konsentrasi DEET saka 10-14 nganti 10-5 M nuduhake yen dawa kapiler tekan plateau ing 10-8 M DEET (Gambar Tambahan S2). Ora ana bedane sing signifikan sing ditemokake ing efek proangiogenik in vitro saka HUVEC sing diobati nganggo DEET ing kisaran konsentrasi 10-8 M lan 10-5 M.
Kanggo nemtokake efek DEET marang neovaskularisasi, kita nindakake studi neovaskularisasi in vivo. Sawise 14 dina, tikus sing diinjeksi sel endotel sing dikultur nganggo 10-8 M utawa 10-5 M DEET nuduhake peningkatan kandungan hemoglobin sing signifikan (Gambar 1c, garis putih).
Salajengipun, neovaskularisasi sing diinduksi DEET ditliti ing tikus sing nggawa xenograft U87MG sing diinjeksi saben dina (ip) karo DEET kanthi dosis sing dikenal bisa nyebabake konsentrasi plasma 10-5 M, sing normal ing manungsa sing kapapar. ing 23. Tumor sing bisa dideteksi (yaiku tumor >100 mm3) diamati 14 dina sawise injeksi sel U87MG menyang tikus. Ing dina kaping 28, pertumbuhan tumor saya tambah sacara signifikan ing tikus sing diobati DEET dibandhingake karo tikus kontrol (Gambar 1d, kothak). Salajengipun, pewarnaan CD31 tumor nuduhake yen DEET nambah area kapiler kanthi signifikan nanging ora kapadhetan mikrovaskular. (Gambar 1e–g).
Kanggo nemtokake peran reseptor muskarinik ing proliferasi sing diinduksi DETA, 10-8 M utawa 10-5 M DETA ing ngarsane pFHHSiD (10-7 M, antagonis reseptor M3 selektif) digunakake. Perawatan HUVEC. pFHHSiD mblokir kabeh sifat proliferatif DETA ing kabeh konsentrasi (Tabel 1).
Ing kahanan kasebut, kita uga nliti apa DEET bakal nambah dawa kapiler ing sel HUVEC. Kajaba iku, pFHHSiD kanthi signifikan nyegah dawa kapiler sing diinduksi DEET (Gambar 1a, b, garis abu-abu). Salajengipun, eksperimen sing padha ditindakake karo siRNA M3. Sanajan siRNA kontrol ora efektif kanggo ningkatake pembentukan kapiler, pembungkaman reseptor muskarinik M3 ngilangi kemampuan DEET kanggo nambah dawa kapiler (Gambar 1a, b, garis ireng).
Salajengipun, vaskularisasi in vitro lan neovaskularisasi in vivo sing diinduksi 10-8 M utawa 10-5 M DEET diblokir kanthi lengkap dening pFHHSiD (Gambar 1c, d, bunderan). Asil kasebut nuduhake yen DEET ningkatake angiogenesis liwat jalur sing sensitif marang antagonis reseptor M3 selektif utawa siRNA M3.
AChE minangka target molekuler DEET. Obat-obatan kayata donepezil, sing tumindak minangka inhibitor AChE, bisa ngrangsang angiogenesis EC in vitro lan ing model iskemia sikil mburi tikus14. Kita nguji efek saka rong konsentrasi DEET ing aktivitas enzim AChE ing HUVEC. Konsentrasi DEET sing endhek (10-8 M) lan dhuwur (10-5 M) nyuda aktivitas AChE endotel dibandhingake karo kondisi kontrol (Gambar 2).
Kaloro konsentrasi DEET (10-8 M lan 10-5 M) nyuda aktivitas asetilkolinesterase ing HUVEC. BW284c51 (10-5 M) digunakake minangka kontrol kanggo inhibitor asetilkolinesterase. Asil kasebut ditulis minangka persentase aktivitas AChE ing HUVEC sing diobati nganggo rong konsentrasi DEET dibandhingake karo sel sing diobati nganggo kendaraan. Nilai kasebut ditulis minangka rata-rata ± SEM saka enem eksperimen independen. *p < 0,05 dibandhingake karo kontrol (uji perbandingan ganda Kruskal-Wallis lan Dunn).
Nitrat oksida (NO) melu ing proses angiogenik 33, mula, produksi NO ing HUVEC sing distimulasi DEET ditliti. Produksi NO endotel sing diobati DEET tambah dibandhingake karo sel kontrol, nanging mung tekan signifikansi ing dosis 10-8 M (Gambar 3c). Kanggo nemtokake owah-owahan molekuler sing ngontrol produksi NO sing diinduksi DEET, ekspresi lan aktivasi eNOS dianalisis kanthi Western blotting. Sanajan perawatan DEET ora ngowahi ekspresi eNOS, nanging nambah fosforilasi eNOS kanthi signifikan ing situs aktivasi (Ser-1177) nalika nyuda situs hambat (Thr-495) dibandhingake karo sel sing ora diobati ing fosforilasi eNOS (Gambar 3d). Salajengipun, rasio eNOS terfosforilasi ing situs aktivasi lan situs hambat diitung sawise normalisasi jumlah eNOS terfosforilasi karo jumlah total enzim. Rasio iki tambah sacara signifikan ing HUVEC sing diobati karo saben konsentrasi DEET dibandhingake karo sel sing ora diobati (Gambar 3d).
Pungkasan, ekspresi VEGF, salah sawijining faktor proangiogenik utama, dianalisis nganggo Western blotting. DEET nambah ekspresi VEGF kanthi signifikan, dene pFHHSiD mblokir ekspresi iki kanthi lengkap.
Amarga efek DEET sensitif marang blokade farmakologis lan downregulation reseptor M3, kita nguji hipotesis yen DEET bisa nambah sinyal kalsium. Sing nggumunake, DEET gagal nambah kalsium sitoplasma ing HUVEC (data ora ditampilake) lan HEK/M3 (Gambar 4a, b) kanggo loro konsentrasi sing digunakake.
Wektu kiriman: 30 Desember 2024