Pertumbuhan meristem apikal pucuk (SAM) penting kanggo arsitektur batang. Hormon tandurangiberelin(GAs) main peran kunci ing koordinasi wutah tanduran, nanging peran ing SAM tetep kurang dimangerteni. Ing kene, kita ngembangake biosensor ratiometrik saka sinyal GA kanthi ngrancang protein DELLA kanggo nyuda fungsi regulasi sing penting ing respon transkripsi GA nalika njaga degradasi nalika diakoni GA. Kita nduduhake manawa biosensor adhedhasar degradasi iki kanthi akurat nyathet owah-owahan ing tingkat GA lan sensing seluler sajrone pembangunan. Kita nggunakake biosensor iki kanggo peta kegiatan signaling GA ing SAM. Kita nuduhake yen sinyal GA dhuwur biasane ana ing sel sing ana ing antarane primordia organ, sing minangka prekursor sel internode. Nggunakake pendekatan gain- lan mundhut-of-fungsi, kita luwih nduduhake yen GA ngatur orientasi bidang divisi sel, nggawe organisasi seluler kanonik internodes, saéngga ningkatake spesifikasi internode ing SAM.
Meristem apikal pucuk (SAM), dumunung ing pucuk pucuk, ngemot ceruk sel induk sing aktivitas ngasilake organ lateral lan kelenjar batang kanthi cara modular lan iteratif sajrone urip tanduran. Saben unit sing bola-bali, utawa simpul tanduran, kalebu internode lan organ lateral ing kelenjar, lan meristem aksila ing axils godhong1. Wutah lan organisasi simpul tanduran owah-owahan sajrone pangembangan. Ing Arabidopsis, wutah internodal ditindhes nalika tahap vegetatif, lan meristem axillary tetep ora aktif ing axils godhong rosette. Sajrone transisi menyang fase kembang, SAM dadi meristem inflorescence, ngasilake internodes elongated lan tunas axillary, branchlets ing axils saka godhong cauline, lan mengko, kembang tanpa godhong2. Sanajan kita wis nggawe kemajuan sing signifikan ing pangerten mekanisme sing ngontrol wiwitan godhong, kembang, lan cabang, relatif ora ngerti babagan carane internode muncul.
Ngerteni distribusi spatiotemporal GA bakal mbantu luwih ngerti fungsi hormon kasebut ing jaringan sing beda-beda lan ing tahap perkembangan sing beda. Visualisasi degradasi gabungan RGA-GFP sing ditulis ing tumindak promotor dhewe nyedhiyakake informasi penting babagan regulasi tingkat total GA ing roots15,16. Nanging, ekspresi RGA beda-beda ing jaringan17 lan diatur dening GA18. Mangkono, ekspresi diferensial saka promotor RGA bisa nyebabake pola fluoresensi sing diamati karo RGA-GFP lan kanthi mangkono cara iki ora kuantitatif. Paling anyar, bioaktif fluorescein (Fl) -label GA19,20 ngungkapake akumulasi GA ing endocortex root lan regulasi tingkat seluler kanthi transportasi GA. Bubar, sensor GA FRET nlsGPS1 nuduhake yen tingkat GA sesambungan karo elongasi sel ing werna, filamen, lan hypocotyls21 sing peteng. Nanging, kaya sing wis dideleng, konsentrasi GA ora mung siji-sijine parameter sing ngontrol aktivitas sinyal GA, amarga gumantung saka proses sensing kompleks. Ing kene, mbangun pemahaman babagan jalur sinyal DELLA lan GA, kita nglaporake pangembangan lan karakterisasi biosensor ratiometrik adhedhasar degradasi kanggo sinyal GA. Kanggo ngembangake biosensor kuantitatif iki, kita nggunakake RGA sensitif GA mutant sing digabung karo protein fluoresensi lan ana ing ngendi-endi ing jaringan, uga protein fluoresen sing ora sensitif GA. Kita nuduhake yen fusi protein RGA mutant ora ngganggu sinyal GA endogen nalika diungkapake ing ngendi-endi, lan biosensor iki bisa ngitung aktivitas sinyal sing diasilake saka input GA lan pangolahan sinyal GA dening piranti sensing kanthi resolusi spatiotemporal sing dhuwur. Kita nggunakake biosensor iki kanggo peta distribusi spatiotemporal saka aktivitas signaling GA lan ngitung carane GA ngatur prilaku seluler ing epidermis SAM. Kita nduduhake yen GA ngatur orientasi bidang divisi sel SAM sing ana ing antarane primordia organ, saéngga nemtokake organisasi seluler kanonik internode.
Pungkasan, kita takon apa qmRGA bisa nglaporake owah-owahan ing tingkat GA endogen nggunakake hipokotil sing akeh. Kita sadurunge nuduhake yen nitrat ngrangsang wutah kanthi nambah sintesis GA lan, degradasi DELLA34. Dadi, kita mirsani sing dawa hypocotyl ing pUBQ10:: qmRGA tunas thukul ing KALUBÈRAN sumber nitrat (10 mM NO3−) Ngartekno luwih dawa tinimbang ing tunas thukul ing kondisi nitrat-kurang (Tambahan Gambar. 6a). Konsisten karo respon wutah, sinyal GA luwih dhuwur ing hypocotyls saka tunas thukul ing kondisi 10 mM NO3− tinimbang ing tunas thukul tanpa nitrat (Tambahan Gambar. 6b, c). Mangkono, qmRGA uga mbisakake ngawasi owah-owahan ing sinyal GA sing disebabake dening owah-owahan endogen ing konsentrasi GA.
Kanggo mangerteni apa kegiatan signaling GA sing dideteksi dening qmRGA gumantung saka konsentrasi GA lan persepsi GA, kaya sing dikarepake adhedhasar desain sensor, kita nganalisa ekspresi telung reseptor GID1 ing jaringan vegetatif lan reproduksi. Ing tunas, garis reporter GID1-GUS nuduhake yen GID1a lan c banget dituduhake ing kotiledon (Gambar 3a-c). Kajaba iku, kabeh telung reseptor kasebut dituduhake ing godhong, primordia akar lateral, ujung akar (kajaba tutup ROOT GID1b), lan sistem pembuluh darah (Gambar 3a-c). Ing SAM inflorescence, kita ndeteksi sinyal GUS mung kanggo GID1b lan 1c (Tambahan Gambar 7a-c). Hibridisasi in situ ngonfirmasi pola ekspresi kasebut lan luwih nuduhake yen GID1c diungkapake kanthi seragam ing tingkat sing kurang ing SAM, dene GID1b nuduhake ekspresi sing luwih dhuwur ing pinggiran SAM (Tambahan Gambar 7d-l). Fusi translasi pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b uga ngungkapake sawetara ekspresi GID1b, saka kurang utawa ora ana ekspresi ing tengah SAM nganti ekspresi dhuwur ing wates organ (Tambahan Gambar 7m). Mangkono, reseptor GID1 ora disebarake kanthi seragam lan ing jaringan. Ing nyobi sakteruse, kita uga diamati overexpression saka GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) nambah sensitivitas qmRGA ing hypocotyls kanggo aplikasi GA external (Fig. 3d, e). Ing kontras, fluoresensi diukur dening qd17mRGA ing hypocotyl ora sensitif perawatan GA3 (Fig. 3f, g). Kanggo loro tes kasebut, tunas diobati kanthi konsentrasi GA sing dhuwur (100 μM GA3) kanggo netepake prilaku sensor sing cepet, ing ngendi kemampuan kanggo ikatan karo reseptor GID1 ditambah utawa ilang. Bebarengan, asil iki konfirmasi sing biosensor qmRGA serves fungsi gabungan minangka sensor GA lan GA, lan suggest sing expression diferensial saka reseptor GID1 Ngartekno bisa modulate emissivity saka sensor.
Nganti saiki, distribusi sinyal GA ing SAM tetep ora jelas. Mulane, kita nggunakake tetanduran qmRGA-expressing lan pCLV3 :: mCherry-NLS stem cell reporter35 kanggo ngetung peta kuantitatif resolusi dhuwur saka aktivitas signaling GA, fokus ing lapisan L1 (epidermis; Fig. 4a, b, ndeleng Metode lan Metode Tambahan), wiwit L1 main peran tombol ing kontrol wutah SAM36. Ing kene, pCLV3 :: ekspresi mCherry-NLS nyedhiyakake titik referensi geometris tetep kanggo nganalisa distribusi spasiotemporal saka aktivitas sinyal GA37. Senajan GA dianggep penting kanggo pangembangan organ lateral4, kita mirsani yen sinyal GA kurang ing primordium kembang (P) wiwit saka tahap P3 (Gambar 4a, b), dene primordium P1 lan P2 sing enom nduweni aktivitas moderat sing padha karo ing wilayah tengah (Gambar 4a, b). Aktivitas sinyal GA sing luwih dhuwur dideteksi ing wates primordium organ, diwiwiti ing P1 / P2 (ing pinggir wates) lan puncak ing P4, uga ing kabeh sel wilayah perifer sing ana ing antarane primordia (Gambar 4a, b lan Gambar Tambahan 8a, b). Aktivitas sinyal GA sing luwih dhuwur iki diamati ora mung ing epidermis nanging uga ing lapisan L2 lan L3 ndhuwur (Tambahan Gambar 8b). Pola sinyal GA sing dideteksi ing SAM nggunakake qmRGA uga tetep ora owah saka wektu (Gambar Tambahan 8c-f, k). Senajan mbangun qd17mRGA iki sistematis downregulated ing SAM saka tetanduran T3 saka limang garis independen sing kita ditondoi ing rinci, kita bisa kanggo njelasno pola fluoresensi dijupuk karo pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP mbangun (Tambahan Fig. 8g-j, l). Ing garis kontrol iki, mung owah-owahan cilik ing rasio fluoresensi sing dideteksi ing SAM, nanging ing pusat SAM kita mirsani penurunan sing jelas lan ora dikarepke ing VENUS sing ana gandhengane karo TagBFP. Iki nandheske yen pola sinyal sing diamati dening qmRGA nggambarake degradasi gumantung saka GA saka mRGA-VENUS, nanging uga nduduhake yen qmRGA bisa overestimate kegiatan signaling GA ing pusat meristem. Ing ringkesan, asil kita nuduhake pola sinyal GA sing utamane nuduhake distribusi primordia. Distribusi wilayah inter-primordial (IPR) iki amarga panyiapan bertahap saka aktivitas signaling GA dhuwur antarane primordium berkembang lan wilayah tengah, nalika ing wektu sing padha aktivitas signaling GA ing primordium sudo (Fig. 4c, d).
Distribusi reseptor GID1b lan GID1c (ndeleng ndhuwur) nuduhake yen ekspresi diferensial reseptor GA mbantu mbentuk pola aktivitas sinyal GA ing SAM. Kita kepingin weruh apa akumulasi diferensial GA bisa uga melu. Kanggo neliti kemungkinan iki, kita nggunakake nlsGPS1 GA FRET sensor21. Peningkatan frekuensi aktivasi dideteksi ing SAM saka nlsGPS1 sing diobati karo 10 μM GA4 + 7 kanggo 100 menit (Tambahan Gambar 9a-e), nuduhake yen nlsGPS1 nanggapi owah-owahan konsentrasi GA ing SAM, kaya ing roots21. Distribusi spasial frekuensi aktivasi nlsGPS1 nuduhake tingkat GA sing relatif kurang ing lapisan njaba SAM, nanging nuduhake yen padha munggah ing tengah lan ing wates SAM (Gambar 4e lan Gambar Tambahan 9a, c). Iki nuduhake yen GA uga disebarake ing SAM kanthi pola spasial sing bisa dibandhingake karo qmRGA. Minangka pendekatan pelengkap, kita uga dianggep SAM karo neon GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) utawa Fl piyambak minangka kontrol negatif. Sinyal Fl disebarake ing saindhenging SAM, kalebu wilayah tengah lan primordium, sanajan kanthi intensitas sing luwih murah (Gambar 4j lan Gambar Tambahan 10d). Ing kontras, kabeh telung GA-Fl akumulasi khusus ing wates primordium lan beda-beda derajat ing liyane saka IPR, karo GA7-Fl accumulating ing domain paling gedhé ing IPR (Fig. 4k lan Tambahan Fig. 10a, b). Kuantifikasi intensitas fluoresensi nyatakake yen rasio intensitas IPR kanggo non-IPR luwih dhuwur ing SAM sing diobati GA-Fl dibandhingake karo SAM sing diobati Fl (Gambar 4l lan Gambar Tambahan 10c). Bebarengan, asil kasebut nuduhake yen GA ana ing konsentrasi sing luwih dhuwur ing sel IPR sing paling cedhak karo wates organ. Iki nuduhake yen pola aktivitas sinyal SAM GA asil saka ekspresi diferensial reseptor GA lan akumulasi diferensial GA ing sel IPR cedhak wates organ. Mangkono, analisis kita ngungkapake pola spatiotemporal sinyal GA sing ora dikarepke, kanthi aktivitas sing luwih murah ing tengah lan primordium SAM lan aktivitas sing luwih dhuwur ing IPR ing wilayah periferal.
Kanggo mangerteni peran aktivitas signaling GA diferensial ing SAM, kita nganalisa korélasi antara aktivitas sinyal GA, ekspansi sel, lan divisi sel nggunakake imaging wektu-wektu wektu nyata saka SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. Amarga peran GA ing regulasi pertumbuhan, korélasi positif karo paramèter ekspansi sel wis samesthine. Mula, kita mbandhingake peta aktivitas sinyal GA kanthi peta tingkat pertumbuhan permukaan sel (minangka proksi kekuatan ekspansi sel kanggo sel tartamtu lan sel putri ing divisi) lan peta anisotropi pertumbuhan, sing ngukur arah ekspansi sel (uga digunakake ing kene kanggo sel tartamtu lan sel putri ing divisi; Fig. 5a, b, ndeleng Metode lan Metode Tambahan). Peta tingkat pertumbuhan permukaan sel SAM kita konsisten karo pengamatan sadurunge38,39, kanthi tingkat pertumbuhan minimal ing wates lan tingkat pertumbuhan maksimal ing kembang ngembang (Gambar 5a). Analisis komponen utama (PCA) nuduhake yen aktivitas sinyal GA ana hubungane negatif karo intensitas pertumbuhan permukaan sel (Gambar 5c). Kita uga nuduhake yen sumbu utama variasi, kalebu input sinyal GA lan intensitas wutah, padha ortogonal menyang arah sing ditemtokake dening ekspresi CLV3 sing dhuwur, ngonfirmasi pengecualian sel saka pusat SAM ing analisis sing isih ana. Analisis korelasi Spearman ngonfirmasi asil PCA (Gambar 5d), nuduhake yen sinyal GA sing luwih dhuwur ing IPR ora nyebabake ekspansi sel sing luwih dhuwur. Nanging, analisis korélasi ngungkapake korélasi positif tipis antara aktivitas sinyal GA lan anisotropi pertumbuhan (Gambar 5c, d), sing nuduhake yen sinyal GA sing luwih dhuwur ing IPR mengaruhi arah pertumbuhan sel lan bisa uga posisi bidang divisi sel.
a, b Peta panas rata-rata wutah lumahing (a) lan wutah anisotropi (b) ing SAM rata-rata liwat pitung tetanduran sawijining (digunakake minangka proxy kanggo kekuatan lan arah expansion sel, mungguh). c Analisis PCA kalebu variabel ing ngisor iki: sinyal GA, intensitas pertumbuhan permukaan, anisotropi pertumbuhan permukaan, lan ekspresi CLV3. Komponen PCA 1 utamane hubungane negatif karo intensitas pertumbuhan permukaan lan hubungane positif karo sinyal GA. Komponen PCA 2 utamane ana hubungane positif karo anisotropi pertumbuhan permukaan lan hubungane negatif karo ekspresi CLV3. Persentase nggambarake variasi sing diterangake saben komponen. d Analisis korélasi Spearman antarane sinyal GA, intensitas wutah lumahing, lan anisotropi wutah lumahing ing skala tissue ora kalebu CZ. Nomer ing sisih tengen punika Spearman rho Nilai antarane rong variabel. Tanda bintang nuduhake kasus sing korélasi / korélasi negatif banget signifikan. e Visualisasi 3D sel Col-0 SAM L1 kanthi mikroskop confocal. Tembok sel anyar sing dibentuk ing SAM (nanging dudu primordium) ing jam 10 diwarnai miturut nilai sudut. Bar werna ditampilake ing pojok tengen ngisor. Inset nuduhake gambar 3D sing cocog ing 0 h. Eksperimen kasebut diulang kaping pindho kanthi asil sing padha. f Box plot nampilake tingkat divisi sel ing IPR lan non-IPR Col-0 SAM (n = 10 tanduran independen). Garis tengah nuduhake median, lan wates kothak nuduhake persentil 25 lan 75. Kumis nuduhake nilai minimal lan maksimum sing ditemtokake karo piranti lunak R. Nilai P dipikolehi kanthi t-test Welch's two-tailed. g, h diagram skematis sing nuduhake (g) cara ngukur sudut tembok sel anyar (magenta) babagan arah radial saka tengah SAM (garis titik putih) (mung nilai sudut akut, yaiku, 0-90 °, sing dianggep), lan (h) arah circumferential / lateral lan radial ing meristem. i Frekuensi histogram orientasi bidang divisi sel ngliwati SAM (biru peteng), IPR (biru medium), lan non-IPR (biru muda). Nilai P dipikolehi kanthi tes Kolmogorov-Smirnov rong buntut. Eksperimen kasebut diulang kaping pindho kanthi asil sing padha. j Frekuensi histogram orientasi bidang pembelahan sel saka IPR watara P3 (ijo cahya), P4 (ijo medium), lan P5 (ijo peteng). Nilai P dipikolehi kanthi tes Kolmogorov-Smirnov rong buntut. Eksperimen kasebut diulang kaping pindho kanthi asil sing padha.
Mulane, sabanjure kita nyelidiki korélasi antara sinyal GA lan aktivitas divisi sel kanthi ngenali tembok sel sing mentas kawangun sajrone assay (Gambar 5e). Pendekatan iki ngidini kita ngukur frekuensi lan arah divisi sel. Kaget, kita nemokake yen frekuensi divisi sel ing IPR lan sisa SAM (non-IPR, Fig. 5f) padha, nuduhake yen beda sinyal GA antarane sel IPR lan non-IPR ora mengaruhi divisi sel. Iki, lan korélasi positif antarane sinyal GA lan anisotropi wutah, njalari kita nimbang apa kegiatan signaling GA bisa mengaruhi orientasi bidang divisi sel. Kita ngukur orientasi tembok sel anyar minangka sudut akut sing relatif marang sumbu radial sing nyambungake pusat meristem lan tengah tembok sel anyar (Gambar 5e-i) lan mirsani kecenderungan sing jelas kanggo sel dibagi ing sudut sing cedhak karo 90 ° relatif marang sumbu radial, kanthi frekuensi paling dhuwur sing diamati ing 70-80 ° lan 70-80 °. (22,62%) (Gambar 5e, i), cocog karo divisi sel ing arah circumferential / transversal (Gambar 5h). Kanggo mriksa kontribusi sinyal GA kanggo prilaku divisi sel iki, kita nganalisa parameter divisi sel ing IPR lan non-IPR kanthi kapisah (Gambar 5i). Kita mirsani manawa distribusi sudut divisi ing sel IPR beda karo sel non-IPR utawa ing sel ing kabeh SAM, kanthi sel IPR nuduhake proporsi sing luwih dhuwur saka divisi sel lateral / bunder, yaiku, 70-80 ° lan 80-90 ° (33.86% lan 30.71%, masing-masing, proporsi sing cocog karo Fig 5). Mangkono, pengamatan kita nuduhake asosiasi antarane sinyal GA dhuwur lan orientasi bidang divisi sel sing cedhak karo arah circumferential, padha karo korélasi antara aktivitas signaling GA lan anisotropi pertumbuhan (Gambar 5c, d). Kanggo luwih netepake konservasi spasial asosiasi iki, kita ngukur orientasi bidang divisi ing sel IPR ngubengi primordium wiwit saka P3, amarga aktivitas sinyal GA paling dhuwur dideteksi ing wilayah iki wiwit saka P4 (Gambar 4). Sudut divisi saka IPR watara P3 lan P4 ora nuduhake prabédan sing signifikan sacara statistik, sanajan frekuensi tambah saka divisi sel lateral diamati ing IPR watara P4 (Gambar 5j). Nanging, ing sel IPR watara P5, prabédan ing orientasi bidang divisi sel dadi pinunjul sacara statistik, kanthi paningkatan frekuensi divisi sel transversal (Gambar 5j). Bebarengan, asil kasebut nuduhake yen sinyal GA bisa ngontrol orientasi divisi sel ing SAM, sing konsisten karo laporan sadurunge40,41 yen sinyal GA dhuwur bisa nyebabake orientasi lateral divisi sel ing IPR.
Diprediksi yen sel ing IPR ora bakal digabung menyang primordia nanging dadi internodes2,42,43. Orientasi transversal saka divisi sel ing IPR bisa nyebabake organisasi khas baris longitudinal paralel sel epidermis ing internodes. Pengamatan kita sing diterangake ing ndhuwur nuduhake yen sinyal GA bisa uga duwe peran ing proses iki kanthi ngatur arah divisi sel.
Mundhut fungsi sawetara gen DELLA nyebabake respon GA konstitutif, lan mutan della bisa digunakake kanggo nguji hipotesis iki44. Kita pisanan nganalisa pola ekspresi limang gen DELLA ing SAM. Fusi transkripsi saka GUS line45 ngandhakake yen GAI, RGA, RGL1, lan RGL2 (nganti luwih sithik) ditulis ing SAM (Tambahan Gambar 11a-d). Hibridisasi in situ luwih nuduhake manawa GAI mRNA nglumpukake khusus ing primordia lan kembang ngembang (Tambahan Gambar 11e). RGL1 lan RGL3 mRNA dideteksi ing saindhenging kanopi SAM lan ing kembang lawas, dene RGL2 mRNA luwih akeh ing wilayah tapel wates (Tambahan Gambar 11f-h). Pencitraan confocal pRGL3 :: RGL3-GFP SAM dikonfirmasi ekspresi sing diamati dening hibridisasi in situ lan nuduhake yen protein RGL3 akumulasi ing bagian tengah SAM (Tambahan Gambar 11i). Nggunakake baris pRGA :: GFP-RGA, kita uga nemokake protein RGA accumulates ing SAM, nanging turah mbrawah sudo ing tapel wates wiwit saka P4 (Tambahan Fig. 11j). Utamane, pola ekspresi RGL3 lan RGA konsisten karo aktivitas sinyal GA sing luwih dhuwur ing IPR, kaya sing dideteksi dening qmRGA (Fig. 4). Kajaba iku, data kasebut nuduhake yen kabeh DELLA ditulis ing SAM lan ekspresi kasebut sacara kolektif ngluwihi kabeh SAM.
Sabanjure, analisa paramèter divisi sel ing SAM jinis liar (Ler, kontrol) lan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutan (Fig. 6a, b). Apike, kita mirsani owah-owahan sing signifikan sacara statistik ing distribusi frekuensi amba divisi sel ing della global mutant SAM dibandhingake jinis alam bébas (Fig. 6c). Owah-owahan ing della global mutant iki amarga mundhak ing frekuensi saka sudhut 80-90 ° (34,71% vs 24,55%) lan, kanggo ombone kurang, 70-80 ° sudhut (23,78% vs 20,18%), IE, cocog karo divisi sel transversal (Gambar 6c). Frekuensi divisi non-transversal (0-60 °) uga luwih murah ing mutan global della (Gambar 6c). Frekuensi divisi sel transversal tambah akeh ing SAM saka mutan global della (Gambar 6b). Frekuensi divisi sel transversal ing IPR uga luwih dhuwur ing mutan global della dibandhingake karo jinis liar (Gambar 6d). Ing njaba wilayah IPR, jinis liar nduweni distribusi sing luwih seragam saka sudut divisi sel, dene mutan global della luwih milih divisi tangensial kaya IPR (Fig. 6e). Kita uga ngitung orientasi divisi sel ing SAM saka ga2 oxidase (ga2ox) mutan quintuple (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, lan ga2ox6-2), latar mburi mutan GA-ora aktif ing ngendi GA akumulasi. Konsisten karo paningkatan tingkat GA, SAM saka inflorescence mutant quintuple ga2ox luwih gedhe tinimbang Col-0 (Tambahan Fig. 12a, b), lan dibandhingake karo Col-0, quintuple ga2ox SAM nuduhake distribusi sudut divisi sel sing beda-beda, kanthi frekuensi sudut mundhak saka 50 ° menyang 90. 12a–c). Mangkono, kita nuduhake yen aktivasi konstitutif saka sinyal GA lan akumulasi GA nyebabake divisi sel lateral ing IPR lan sisa SAM.
a, b visualisasi 3D saka lapisan L1 saka PI-stained Ler (a) lan global della mutant (b) SAM nggunakake mikroskop confocal. Tembok sel anyar sing dibentuk ing SAM (nanging dudu primordium) sajrone wektu 10 jam ditampilake lan diwarnai miturut nilai sudut. Inset nuduhake SAM ing 0 h. Bar werna ditampilake ing pojok tengen ngisor. Panah ing (b) nuduhake conto file sel sing didadekake siji ing della mutant global. Eksperimen kasebut diulang kaping pindho kanthi asil sing padha. ce comparison saka distribusi frekuensi saka orientasi bidang divisi sel ing kabèh SAM (d), IPR (e), lan non-IPR (f) antarane Ler lan della global. Nilai P dipikolehi kanthi nggunakake tes Kolmogorov-Smirnov rong buntut. f, g Visualisasi 3D saka gambar confocal saka SAM diwarnai PI saka Col-0 (i) lan pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) tetanduran transgenik. Panel (a, b) nuduhake tembok sel anyar (nanging ora primordia) dibentuk ing SAM sajrone 10 jam. Eksperimen kasebut diulang kaping pindho kanthi asil sing padha. h–j Perbandingan distribusi frekuensi orientasi bidang divisi sel dumunung ing kabeh SAM (h), IPR (i) lan non-IPR (j) antarane tanduran Col-0 lan pCUC2 :: gai-1-VENUS. Nilai P dipikolehi kanthi nggunakake tes Kolmogorov-Smirnov rong buntut.
Sabanjure, kita nyoba efek nyegah sinyal GA khusus ing IPR. Kanggo tujuan iki, kita nggunakake promotor cup cotyledon 2 (CUC2) kanggo nyopir ekspresi protein gai-1 negatif dominan sing digabung karo VENUS (ing garis pCUC2 :: gai-1-VENUS). Ing SAM liar-jinis, promotor CUC2 drive expression saka paling IPRs ing SAM, kalebu sel wewatesan, saka P4 terus, lan expression tartamtu padha diamati ing pCUC2 :: gai-1-VENUS tetanduran (ndeleng ngisor). Distribusi sudut divisi sel ing SAM utawa IPR saka pCUC2 :: gai-1-VENUS tetanduran ora beda banget saka jinis alam bébas, sanajan ora dikarepke kita ketemu sing sel tanpa IPR ing tetanduran iki dibagi ing frekuensi luwih saka 80-90 ° (Fig. 6f-j).
Wis disaranake yen arah divisi sel gumantung saka geometri SAM, utamane tegangan tarik sing diasilake dening kelengkungan jaringan46. Mulane kita takon apa wangun SAM diowahi ing della global mutant lan pCUC2 :: gai-1-VENUS tetanduran. Kaya sing dilaporake sadurunge12, ukuran SAM mutant della global luwih gedhe tinimbang jinis liar (Tambahan Gambar 13a, b, d). Hibridisasi in situ saka CLV3 lan STM RNA ngonfirmasi ekspansi meristem ing mutan della lan luwih nuduhake ekspansi lateral niche sel stem (Tambahan Gambar 13e, f, h, i). Nanging, kelengkungan SAM padha ing loro genotipe (Tambahan Gambar 13k, m, n, p). We diamati Tambah padha ing ukuran ing gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant tanpa owah-owahan ing kelengkungan dibandhingake jinis alam bébas (Tambahan Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Frekuensi orientasi divisi sel uga kena pengaruh ing della quadruple mutan, nanging luwih sithik tinimbang ing della monolithic mutant (Tambahan Gambar 12d-f). Efek dosis iki, bebarengan karo kurang efek ing kelengkungan, nyaranake yen aktivitas RGL3 residual ing Della quadruple mutant mbatesi owah-owahan ing orientasi divisi sel sing disebabake dening mundhut aktivitas DELLA lan owah-owahan ing divisi sel lateral kedadeyan minangka respon kanggo owah-owahan ing aktivitas signaling GA tinimbang owah-owahan ing geometri SAM. Kaya sing kasebut ing ndhuwur, promotor CUC2 nyopir ekspresi IPR ing SAM wiwit P4 (Tambahan Gambar 14a, b), lan kontras, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM nduweni ukuran sing suda nanging lengkungan sing luwih dhuwur (Tambahan Gambar 14c-h). Owah-owahan ing morfologi pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM bisa nyebabake distribusi tekanan mekanik sing beda dibandhingake karo jinis alam bébas, ing ngendi tekanan circumferential dhuwur diwiwiti kanthi jarak sing luwih cendhek saka pusat SAM47. Utawa, owah-owahan ing morfologi pCUC2:: gai-1-VENUS SAM bisa uga amarga owah-owahan sifat mekanik regional sing disebabake dening ekspresi transgene48. Ing kasus loro, iki bisa ngimbangi sebagian efek saka owah-owahan ing sinyal GA kanthi nambah kemungkinan sel bakal dibagi ing orientasi circumferential / transversal, nerangake pengamatan kita.
Digabungake, data kita konfirmasi yen sinyal GA sing luwih dhuwur nduweni peran aktif ing orientasi lateral bidang divisi sel ing IPR. Padha uga nuduhake yen kelengkungan meristem uga mengaruhi orientasi bidang divisi sel ing IPR.
Orientasi transversal saka bidang divisi ing IPR, amarga aktivitas sinyal GA sing dhuwur, nuduhake yen GA wis ngatur file sel radial ing epidermis ing SAM kanggo nemtokake organisasi seluler sing bakal ditemokake ing internode epidermis. Pancen, file sel kasebut kerep katon ing gambar SAM saka mutan global della (Gambar 6b). Mangkono, kanggo luwih njelajah fungsi pangembangan pola spasial GA signaling ing SAM, kita nggunakake time-lapse imaging kanggo nganalisa organisasi spasial sel ing IPR ing wild-type (Ler lan Col-0), della mutan global, lan pCUC2 :: gai-1-VENUS tetanduran transgenik.
Kita nemokake yen qmRGA nuduhake yen aktivitas signaling GA ing IPR mundhak saka P1 / P2 lan puncak ing P4, lan pola iki tetep terus-terusan sajrone wektu (Gambar 4a-f lan Gambar Tambahan 8c-f, k). Kanggo nganalisa organisasi spasial sel ing IPR kanthi nambah sinyal GA, kita menehi label sel IPR Ler ing ndhuwur lan ing sisih pinggir P4 miturut nasib perkembangan sing dianalisis 34 jam sawise pengamatan pisanan, yaiku, luwih saka rong kaping plastid, ngidini kita ngetutake sel IPR sajrone pangembangan primordium saka P1 / P2 nganti P4. Kita nggunakake telung warna sing beda: kuning kanggo sel sing digabungake menyang primordium cedhak P4, ijo kanggo sing ana ing IPR, lan ungu kanggo sing melu proses kasebut (Fig. 7a-c). Ing t0 (0 h), 1-2 lapisan sel IPR katon ing ngarep P4 (Gambar 7a). Kaya sing dikarepake, nalika sel kasebut dibagi, utamane liwat bidang divisi transversal (Gambar 7a-c). Asil sing padha dipikolehi nggunakake Col-0 SAM (fokus ing P3, sing wates lipatan padha karo P4 ing Ler), sanajan ing genotipe iki lipatan sing dibentuk ing wates kembang ndhelikake sel IPR luwih cepet (Fig. 7g-i). Mangkono, pola divisi sel IPR wis ngatur sel dadi baris radial, kaya ing internodes. Organisasi baris radial lan lokalisasi sel IPR antarane organ sing berturut-turut nuduhake yen sel kasebut minangka progenitor internodal.
Ing kene, kita ngembangake biosensor signaling GA ratiometric, qmRGA, sing ngidini pemetaan kuantitatif aktivitas signaling GA asil saka gabungan konsentrasi reseptor GA lan GA nalika nyilikake interferensi karo jalur sinyal endogen, saéngga nyedhiyakake informasi babagan fungsi GA ing tingkat seluler. Kanggo tujuan iki, kita mbangun protein DELLA sing diowahi, mRGA, sing wis ilang kemampuan kanggo ngiket mitra interaksi DELLA nanging tetep sensitif marang proteolisis sing diakibatake GA. qmRGA nanggapi owah-owahan eksogen lan endogen ing tingkat GA, lan sifat sensing dinamis mbisakake penilaian owah-owahan spatiotemporal ing aktivitas sinyal GA sajrone pembangunan. qmRGA uga minangka alat sing fleksibel banget amarga bisa diadaptasi menyang jaringan sing beda-beda kanthi ngganti promotor sing digunakake kanggo ekspresi kasebut (yen perlu), lan diwenehi sifat konservasi jalur sinyal GA lan motif PFYRE ing antarane angiosperma, kemungkinan bisa ditransfer menyang spesies liyane22. Selaras karo iki, mutasi sing padha karo protein SLR1 DELLA beras (HYY497AAA) uga ditampilake kanggo nyuda aktivitas repressor pertumbuhan SLR1 nalika mung nyuda degradasi sing dimediasi GA, padha karo mRGA23. Utamane, studi anyar ing Arabidopsis nuduhake yen mutasi asam amino tunggal ing domain PFYRE (S474L) ngubah aktivitas transkripsi RGA tanpa mengaruhi kemampuane sesambungan karo mitra faktor transkripsi50. Senajan mutasi iki cedhak banget karo 3 substitusi asam amino sing ana ing mRGA, studi kita nuduhake yen rong mutasi iki ngowahi ciri khas DELLA. Sanajan umume mitra faktor transkripsi ikatan karo domain LHR1 lan SAW saka DELLA26,51, sawetara asam amino sing dikonservasi ing domain PFYRE bisa mbantu nyetabilake interaksi kasebut.
Pangembangan internode minangka ciri utama ing arsitektur tanduran lan asil dandan. qmRGA ngungkapake aktivitas sinyal GA sing luwih dhuwur ing sel progenitor internode IPR. Kanthi nggabungake pencitraan kuantitatif lan genetika, kita nuduhake yen pola sinyal GA superimpose pesawat divisi sel bunder / transversal ing epidermis SAM, mbentuk organisasi divisi sel sing dibutuhake kanggo pangembangan internode. Sawetara regulator orientasi bidang divisi sel wis diidentifikasi sajrone pembangunan52,53. Pakaryan kita menehi conto sing jelas babagan carane kegiatan sinyal GA ngatur parameter seluler iki. DELLA bisa berinteraksi karo kompleks protein prefolding41, supaya sinyal GA bisa ngatur orientasi bidang divisi sel kanthi langsung mengaruhi orientasi mikrotubulus korteks40,41,54,55. Kita ora sengaja nuduhake yen ing SAM, hubungane aktivitas sinyal GA sing luwih dhuwur ora elongasi utawa divisi sel, nanging mung anisotropi pertumbuhan, sing konsisten karo efek langsung GA ing arah divisi sel ing IPR. Nanging, kita ora bisa ngilangi manawa efek iki bisa uga ora langsung, contone ditengahi dening softening tembok sel sing diakibatake GA56. Owah-owahan ing sifat tembok sel nyebabake stres mekanik57,58, sing uga bisa mengaruhi orientasi bidang divisi sel kanthi mengaruhi orientasi mikrotubulus korteks39,46,59. Efek gabungan saka stres mekanik sing diakibatake GA lan regulasi langsung saka orientasi microtubule dening GA bisa uga melu ngasilake pola tartamtu saka orientasi divisi sel ing IPR kanggo nemtokake internodes, lan studi luwih lanjut dibutuhake kanggo nguji gagasan iki. Kajaba iku, studi sadurunge wis nyorot pentinge DELLA-interacting protein TCP14 lan 15 ing kontrol formasi internode60,61 lan faktor-faktor kasebut bisa dadi mediasi tumindak GA bebarengan karo BREVIPEDICELLUS (BP) lan PENNYWISE (PNY), sing ngatur pangembangan internode lan wis ditampilake kanggo mengaruhi signaling GA2,62. Amarga DELLA interaksi karo brassinosteroid, etilena, asam jasmonic, lan asam absisat (ABA) signaling pathways63,64 lan hormon iki bisa mengaruhi microtubule orientation65, efek saka GA ing orientasi divisi sel bisa uga ditengahi dening hormon liyane.
Panaliten sitologi awal nuduhake yen wilayah njero lan njaba SAM Arabidopsis dibutuhake kanggo pangembangan internode2,42. Kasunyatan yen GA aktif ngatur divisi sel ing jaringan jero12 ndhukung fungsi ganda GA kanggo ngatur ukuran meristem lan internode ing SAM. Pola divisi sel arah uga diatur kanthi rapet ing jaringan SAM njero, lan aturan iki penting kanggo pertumbuhan batang52. Bakal dadi menarik kanggo nliti apa GA uga nduweni peran ing orientasi bidang divisi sel ing organisasi SAM batin, saéngga nyinkronake spesifikasi lan pangembangan internode ing SAM.
Tanduran ditanam ing vitro ing lemah utawa 1x medium Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) ditambah karo sukrosa 1% lan 1% agar (Sigma) ing kondisi standar (cahaya 16 jam, 22 °C), kajaba kanggo eksperimen pertumbuhan hipokotil lan oyod ing ngendi tunas ditanam ing piring vertikal ing cahya konstan lan 22 °C. Kanggo eksperimen nitrat, tanduran ditanam ing medium MS sing dimodifikasi (media tanduran bioWORLD) sing ditambah karo nitrat sing cukup (0 utawa 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suksinat, 1% sukrosa lan 1% A-agar (Sigma) ing kahanan suwene dina.
GID1a cDNA sing dilebokake ing pDONR221 digabungake karo pDONR P4-P1R-pUBQ10 lan pDONR P2R-P3-mCherry menyang pB7m34GW kanggo ngasilake pUBQ10 :: GID1a-mCherry. DNA IDD2 sing dilebokake ing pDONR221 digabungake maneh dadi pB7RWG266 kanggo ngasilake p35S: IDD2-RFP. Kanggo ngasilake pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b, fragmen 3.9 kb ing hulu wilayah kodhe GID1b lan fragmen 4.7 kb sing ngemot cDNA GID1b (1.3 kb) lan terminator (3.4 kb) pisanan digedhekake nggunakake primer ing PNR1P lan banjur dilebokake ing Tabel Tambahan 3 PNR. Fisher Scientific) lan pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), lan pungkasane digabungake maneh karo pDONR221 2xmTQ268 menyang vektor target pGreen 012567 nggunakake kloning Gateway. Kanggo ngasilake pCUC2 :: LSSmOrange, urutan promotor CUC2 (3229 bp hulu ATG) diikuti urutan pengkodean mOrange Stokes-shifted gedhe (LSSmOrange) 69 kanthi sinyal lokalisasi nuklir N7 lan terminator transkripsi NOS dirakit menyang sistem pGreenment refragment kanamycin gateway. (Invitrogen). Vektor biner tanduran dienalaken ing galur Agrobacterium tumefaciens GV3101 lan dilebokake ing godhong Nicotiana benthamiana kanthi metode infiltrasi Agrobacterium lan ing Arabidopsis thaliana Col-0 kanthi metode dip kembang. pUBQ10 :: qmRGA pUBQ10 :: GID1a-mCherry lan pCLV3 :: mCherry-NLS qmRGA diisolasi saka progenies F3 lan F1 saka salib masing-masing.
Hibridisasi RNA in situ ditindakake ing pucuk pucuk sing dawane kira-kira 1 cm72, sing diklumpukake lan langsung dipasang ing larutan FAA (3,7% formaldehida, 5% asam asetat, 50% etanol) sing wis didinginake nganti 4 °C. Sawise perawatan vakum 2 × 15 menit, fiksatif diganti lan sampel diinkubasi sewengi. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, lan RGL3 cDNAs lan probe antisense menyang 3′-UTRs padha disintesis nggunakake primer ditampilake ing Tabel Tambahan 3 minangka diterangake dening Rosier et al.73. Probe berlabel digoxigenin dideteksi kanthi immunodetected nggunakake antibodi digoxigenin (pengenceran 3000 kali lipat; Roche, nomer katalog: 11 093 274 910), lan bagean diwarnai karo 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat (BCIP, 250-foldlyl phosphate)trafold (BCIP, 250-fold lyumblue-trafold, BT. dilution) solusi.
Wektu kirim: Feb-10-2025