Pertumbuhan meristem apikal pucuk (SAM) penting banget kanggo arsitektur batang. Hormon tandurangiberelin(GA) nduweni peran penting kanggo koordinasi pertumbuhan tanduran, nanging perane ing SAM isih durung dingerteni kanthi becik. Ing kene, kita ngembangake biosensor rasiometrik sinyal GA kanthi ngrancang protein DELLA kanggo nyuda fungsi pengaturan penting ing respon transkripsi GA nalika njaga degradasi nalika pangenalan GA. Kita nduduhake manawa biosensor adhedhasar degradasi iki kanthi akurat nyathet owah-owahan ing tingkat GA lan penginderaan seluler sajrone pangembangan. Kita nggunakake biosensor iki kanggo memetakan aktivitas sinyal GA ing SAM. Kita nuduhake manawa sinyal GA sing dhuwur ana utamane ing sel sing dumunung ing antarane primordia organ, sing minangka prekursor kanggo sel internode. Nggunakake pendekatan gain- lan loss-of-function, kita luwih lanjut nduduhake manawa GA ngatur orientasi bidang divisi sel, netepake organisasi seluler kanonik internodes, saengga ningkatake spesifikasi internode ing SAM.
Meristem apikal tunas (SAM), sing dumunung ing pucuk tunas, ngemot relung sel punca sing aktivitase ngasilake organ lateral lan simpul batang kanthi cara modular lan iteratif sajrone urip tanduran. Saben unit sing bola-bali iki, utawa simpul tanduran, kalebu ruas lan organ lateral ing simpul, lan meristem aksila ing ketiak godhong1. Pertumbuhan lan organisasi simpul tanduran owah sajrone perkembangan. Ing Arabidopsis, pertumbuhan internodal ditekan sajrone tahap vegetatif, lan meristem aksila tetep ora aktif ing ketiak godhong roset. Sajrone transisi menyang fase kembang, SAM dadi meristem infloresensi, ngasilake ruas lan tunas aksila sing dawa, cabang ing ketiak godhong cauline, lan mengko, kembang tanpa godhong2. Sanajan kita wis nggawe kemajuan sing signifikan ing pangerten mekanisme sing ngontrol inisiasi godhong, kembang, lan cabang, relatif sithik sing dingerteni babagan kepiye ruas muncul.
Pangerten distribusi spatiotemporal GA bakal mbantu luwih ngerti fungsi hormon kasebut ing jaringan sing beda lan ing tahap perkembangan sing beda. Visualisasi degradasi fusi RGA-GFP sing diekspresikan ing sangisore aksi promotor dhewe nyedhiyakake informasi penting babagan regulasi tingkat GA total ing oyot15,16. Nanging, ekspresi RGA beda-beda ing antarane jaringan17 lan diatur dening GA18. Mangkono, ekspresi diferensial promotor RGA bisa nyebabake pola fluoresensi sing diamati karo RGA-GFP lan mula metode iki ora kuantitatif. Bubar iki, bioaktif fluorescein (Fl)-labeled GA19,20 nuduhake akumulasi GA ing endokorteks oyot lan regulasi tingkat seluler kanthi transportasi GA. Bubar iki, sensor GA FRET nlsGPS1 nuduhake yen tingkat GA berkorelasi karo pemanjangan sel ing oyot, filamen, lan hipokotil sing thukul peteng21. Nanging, kaya sing wis dideleng, konsentrasi GA dudu siji-sijine parameter sing ngontrol aktivitas sinyal GA, amarga gumantung saka proses penginderaan sing kompleks. Ing kene, adhedhasar pangerten kita babagan jalur sinyal DELLA lan GA, kita nglaporake pangembangan lan karakterisasi biosensor rasiometrik adhedhasar degradasi kanggo sinyal GA. Kanggo ngembangake biosensor kuantitatif iki, kita nggunakake RGA sensitif GA mutan sing digabungake karo protein fluoresen lan diekspresikan ing endi-endi ing jaringan, uga protein fluoresen sing ora sensitif GA. Kita nuduhake yen fusi protein RGA mutan ora ngganggu sinyal GA endogen nalika diekspresikan ing endi-endi, lan biosensor iki bisa ngetung aktivitas sinyal sing diasilake saka input GA lan pamrosesan sinyal GA dening aparatus penginderaan kanthi resolusi spatiotemporal sing dhuwur. Kita nggunakake biosensor iki kanggo memetakan distribusi spatiotemporal saka aktivitas sinyal GA lan ngetung kepiye GA ngatur prilaku seluler ing epidermis SAM. Kita nduduhake yen GA ngatur orientasi bidang divisi sel SAM sing dumunung ing antarane primordia organ, saengga nemtokake organisasi seluler kanonik saka internode.
Pungkasan, kita takon apa qmRGA bisa nglaporake owah-owahan ing tingkat GA endogen nggunakake hipokotil sing lagi tuwuh. Sadurunge, kita nuduhake yen nitrat ngrangsang wutah kanthi nambah sintesis GA lan, sabanjure, degradasi DELLA34. Mula, kita mirsani yen dawa hipokotil ing tunas pUBQ10::qmRGA sing ditandur ing sangisore pasokan nitrat sing akeh (10 mM NO3−) luwih dawa tinimbang tunas sing ditandur ing kahanan kekurangan nitrat (Gambar Tambahan 6a). Konsisten karo respon wutah, sinyal GA luwih dhuwur ing hipokotil tunas sing ditandur ing kahanan 10 mM NO3− tinimbang tunas sing ditandur tanpa nitrat (Gambar Tambahan 6b, c). Mangkono, qmRGA uga ngaktifake pemantauan owah-owahan ing sinyal GA sing disebabake dening owah-owahan endogen ing konsentrasi GA.
Kanggo mangerteni apa aktivitas sinyal GA sing dideteksi dening qmRGA gumantung marang konsentrasi GA lan persepsi GA, kaya sing dikarepake adhedhasar desain sensor, kita nganalisa ekspresi telung reseptor GID1 ing jaringan vegetatif lan reproduksi. Ing tunas, garis reporter GID1-GUS nuduhake yen GID1a lan c diekspresikan kanthi dhuwur ing kotiledon (Gambar 3a-c). Kajaba iku, kabeh telung reseptor diekspresikan ing godhong, primordia oyot lateral, pucuk oyot (kajaba tutup oyot GID1b), lan sistem vaskular (Gambar 3a-c). Ing SAM infloresensi, kita ndeteksi sinyal GUS mung kanggo GID1b lan 1c (Gambar Tambahan 7a-c). Hibridisasi in situ ngonfirmasi pola ekspresi kasebut lan luwih lanjut nuduhake yen GID1c diekspresikan kanthi seragam ing tingkat sing endhek ing SAM, dene GID1b nuduhake ekspresi sing luwih dhuwur ing pinggiran SAM (Gambar Tambahan 7d-l). Fusi translasi pGID1b::2xmTQ2-GID1b uga nuduhake rentang ekspresi GID1b sing bertingkat, saka ekspresi sing kurang utawa ora ana ing tengah SAM nganti ekspresi sing dhuwur ing wates organ (Gambar Tambahan 7m). Dadi, reseptor GID1 ora kasebar kanthi seragam ing antarane lan ing njero jaringan. Ing eksperimen sabanjure, kita uga mirsani yen ekspresi GID1 sing berlebihan (pUBQ10::GID1a-mCherry) nambah sensitivitas qmRGA ing hipokotil kanggo aplikasi GA eksternal (Gambar 3d, e). Kosok baline, fluoresensi sing diukur dening qd17mRGA ing hipokotil ora sensitif marang perawatan GA3 (Gambar 3f, g). Kanggo loro uji coba kasebut, tunas diobati nganggo konsentrasi GA sing dhuwur (100 μM GA3) kanggo netepake prilaku sensor sing cepet, ing ngendi kemampuan kanggo kaiket karo reseptor GID1 saya tambah utawa ilang. Bebarengan, asil iki ngonfirmasi manawa biosensor qmRGA nduweni fungsi gabungan minangka sensor GA lan GA, lan nuduhake manawa ekspresi diferensial reseptor GID1 bisa ngowahi emisivitas sensor kanthi signifikan.
Nganti saiki, distribusi sinyal GA ing SAM isih durung jelas. Mulane, kita nggunakake tanduran sing ngekspresikan qmRGA lan reporter sel punca pCLV3::mCherry-NLS35 kanggo ngetung peta kuantitatif resolusi dhuwur saka aktivitas sinyal GA, kanthi fokus ing lapisan L1 (epidermis; Gambar 4a, b, deleng Metode lan Metode Tambahan), amarga L1 nduweni peran penting kanggo ngontrol pertumbuhan SAM36. Ing kene, ekspresi pCLV3::mCherry-NLS nyedhiyakake titik referensi geometris tetep kanggo nganalisis distribusi spatiotemporal saka aktivitas sinyal GA37. Sanajan GA dianggep penting kanggo perkembangan organ lateral4, kita mirsani manawa sinyal GA kurang ing primordium kembang (P) wiwit saka tahap P3 (Gambar 4a, b), dene primordium P1 lan P2 enom duwe aktivitas moderat sing padha karo ing wilayah tengah (Gambar 4a, b). Aktivitas sinyal GA sing luwih dhuwur dideteksi ing wates primordium organ, diwiwiti saka P1/P2 (ing sisih wates) lan puncak ing P4, uga ing kabeh sel ing wilayah periferal sing dumunung ing antarane primordia (Gambar 4a, b lan Gambar Tambahan 8a, b). Aktivitas sinyal GA sing luwih dhuwur iki diamati ora mung ing epidermis nanging uga ing lapisan L2 lan L3 ndhuwur (Gambar Tambahan 8b). Pola sinyal GA sing dideteksi ing SAM nggunakake qmRGA uga tetep ora owah sajrone wektu (Gambar Tambahan 8c–f, k). Sanajan konstruksi qd17mRGA sacara sistematis mudhun ing SAM saka tanduran T3 saka limang garis independen sing kita ciri kanthi rinci, kita bisa nganalisis pola fluoresensi sing dipikolehi nganggo konstruksi pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Gambar Tambahan 8g–j, l). Ing garis kontrol iki, mung owah-owahan cilik ing rasio fluoresensi sing dideteksi ing SAM, nanging ing pusat SAM kita mirsani penurunan VENUS sing jelas lan ora dikarepke sing ana gandhengane karo TagBFP. Iki ngonfirmasi manawa pola sinyal sing diamati dening qmRGA nggambarake degradasi mRGA-VENUS sing gumantung karo GA, nanging uga nuduhake manawa qmRGA bisa uga ngira-ngira aktivitas sinyal GA ing pusat meristem. Ringkesane, asil kita nuduhake pola sinyal GA sing utamane nggambarake distribusi primordia. Distribusi wilayah antar-primordial (IPR) iki amarga anane aktivitas sinyal GA sing dhuwur ing antarane primordium sing berkembang lan wilayah tengah, dene ing wektu sing padha aktivitas sinyal GA ing primordium mudhun (Gambar 4c, d).
Distribusi reseptor GID1b lan GID1c (deleng ing ndhuwur) nuduhake yen ekspresi reseptor GA sing beda-beda mbantu mbentuk pola aktivitas sinyal GA ing SAM. Kita kepingin weruh apa akumulasi GA sing beda-beda bisa uga ana gandhengane. Kanggo nyelidiki kemungkinan iki, kita nggunakake sensor FRET GA nlsGPS121. Frekuensi aktivasi sing tambah dideteksi ing SAM saka nlsGPS1 sing diobati nganggo 10 μM GA4+7 sajrone 100 menit (Gambar Tambahan 9a–e), nuduhake yen nlsGPS1 nanggapi owah-owahan konsentrasi GA ing SAM, kaya sing ditindakake ing oyot21. Distribusi spasial frekuensi aktivasi nlsGPS1 nuduhake tingkat GA sing relatif rendah ing lapisan njaba SAM, nanging nuduhake yen dheweke luwih dhuwur ing tengah lan ing wates SAM (Gambar 4e lan Gambar Tambahan 9a,c). Iki nuduhake yen GA uga disebar ing SAM kanthi pola spasial sing bisa dibandhingake karo sing diungkapake dening qmRGA. Minangka pendekatan komplementer, kita uga ngolah SAM nganggo GA fluoresen (GA3-, GA4-, GA7-Fl) utawa Fl dhewe minangka kontrol negatif. Sinyal Fl kasebar ing saindenging SAM, kalebu wilayah tengah lan primordium, sanajan kanthi intensitas sing luwih murah (Gambar 4j lan Gambar Tambahan 10d). Kosok baline, kabeh telung GA-Fl nglumpuk khusus ing wates primordium lan kanthi macem-macem derajat ing IPR liyane, kanthi GA7-Fl nglumpuk ing domain paling gedhe ing IPR (Gambar 4k lan Gambar Tambahan 10a, b). Kuantifikasi intensitas fluoresensi nuduhake yen rasio intensitas IPR menyang non-IPR luwih dhuwur ing SAM sing diobati GA-Fl dibandhingake karo SAM sing diobati Fl (Gambar 4l lan Gambar Tambahan 10c). Bebarengan, asil kasebut nuduhake yen GA ana ing konsentrasi sing luwih dhuwur ing sel IPR sing dumunung paling cedhak karo wates organ. Iki nuduhake yen pola aktivitas sinyal SAM GA asil saka ekspresi reseptor GA sing beda lan akumulasi GA sing beda ing sel IPR cedhak wates organ. Dadi, analisis kita nuduhake pola spatiotemporal sinyal GA sing ora dikarepke, kanthi aktivitas sing luwih murah ing tengah lan primordium SAM lan aktivitas sing luwih dhuwur ing IPR ing wilayah periferal.
Kanggo mangerteni peran aktivitas sinyal GA diferensial ing SAM, kita nganalisa korelasi antarane aktivitas sinyal GA, ekspansi sel, lan pembelahan sel nggunakake pencitraan time-lapse wektu nyata saka SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Amarga peran GA ing regulasi pertumbuhan, korelasi positif karo parameter ekspansi sel diarepake. Mulane, kita mbandhingake peta aktivitas sinyal GA karo peta tingkat pertumbuhan permukaan sel (minangka proksi kanggo kekuatan ekspansi sel kanggo sel tartamtu lan kanggo sel anak nalika pembelahan) lan karo peta anisotropi pertumbuhan, sing ngukur arah ekspansi sel (uga digunakake ing kene kanggo sel tartamtu lan kanggo sel anak nalika pembelahan; Gambar 5a,b, deleng Metode lan Metode Tambahan). Peta tingkat pertumbuhan permukaan sel SAM kita konsisten karo pengamatan sadurunge38,39, kanthi tingkat pertumbuhan minimal ing wates lan tingkat pertumbuhan maksimal ing kembang sing berkembang (Gambar 5a). Analisis komponen utama (PCA) nuduhake yen aktivitas sinyal GA berkorelasi negatif karo intensitas pertumbuhan permukaan sel (Gambar 5c). Kita uga nuduhake yen sumbu variasi utama, kalebu input sinyal GA lan intensitas pertumbuhan, ortogonal karo arah sing ditemtokake dening ekspresi CLV3 sing dhuwur, sing ngonfirmasi ora kalebu sel saka pusat SAM ing analisis sing isih ana. Analisis korelasi Spearman ngonfirmasi asil PCA (Gambar 5d), sing nuduhake yen sinyal GA sing luwih dhuwur ing IPR ora nyebabake ekspansi sel sing luwih dhuwur. Nanging, analisis korelasi nuduhake korelasi positif sing sithik antarane aktivitas sinyal GA lan anisotropi pertumbuhan (Gambar 5c, d), sing nuduhake yen sinyal GA sing luwih dhuwur ing IPR mengaruhi arah pertumbuhan sel lan bisa uga posisi bidang divisi sel.
a, b Peta panas rata-rata pertumbuhan permukaan (a) lan anisotropi pertumbuhan (b) ing SAM dirata-rata ing pitung tanduran independen (digunakake minangka proksi kanggo kekuatan lan arah ekspansi sel). c Analisis PCA kalebu variabel ing ngisor iki: sinyal GA, intensitas pertumbuhan permukaan, anisotropi pertumbuhan permukaan, lan ekspresi CLV3. Komponen PCA 1 utamane berkorelasi negatif karo intensitas pertumbuhan permukaan lan berkorelasi positif karo sinyal GA. Komponen PCA 2 utamane berkorelasi positif karo anisotropi pertumbuhan permukaan lan berkorelasi negatif karo ekspresi CLV3. Persentase makili variasi sing diterangake dening saben komponen. d Analisis korelasi Spearman antarane sinyal GA, intensitas pertumbuhan permukaan, lan anisotropi pertumbuhan permukaan ing skala jaringan ora kalebu CZ. Nomer ing sisih tengen yaiku nilai Spearman rho antarane rong variabel. Tanda bintang nuduhake kasus ing ngendi korelasi/korelasi negatif signifikan banget. e Visualisasi 3D sel Col-0 SAM L1 kanthi mikroskop confocal. Dinding sel anyar sing dibentuk ing SAM (nanging dudu primordium) ing 10 jam diwarnai miturut nilai sudut. Garis warna dituduhake ing pojok tengen ngisor. Sisipan nuduhake gambar 3D sing cocog ing jam 0. Eksperimen iki diulang kaping pindho kanthi asil sing padha. f Plot kothak nampilake tingkat pembelahan sel ing IPR lan non-IPR Col-0 SAM (n = 10 tanduran independen). Garis tengah nuduhake median, lan wates kothak nuduhake persentil kaping 25 lan 75. Kumis nuduhake nilai minimum lan maksimum sing ditemtokake nganggo piranti lunak R. Nilai P dipikolehi nganggo uji-t rong buntut Welch. g, h Diagram skematis sing nuduhake (g) carane ngukur sudut dinding sel anyar (magenta) gegayutan karo arah radial saka tengah SAM (garis putus-putus putih) (mung nilai sudut akut, yaiku, 0-90°, sing dianggep), lan (h) arah keliling/lateral lan radial ing njero meristem. i Histogram frekuensi orientasi bidang pembelahan sel ing SAM (biru peteng), IPR (biru medium), lan non-IPR (biru enom). Nilai P dipikolehi kanthi uji Kolmogorov-Smirnov rong sisi. Eksperimen iki diulang kaping pindho kanthi asil sing padha. j Histogram frekuensi orientasi bidang pembelahan sel IPR ing sekitar P3 (ijo enom), P4 (ijo sedheng), lan P5 (ijo peteng). Nilai P dipikolehi kanthi uji Kolmogorov-Smirnov rong sisi. Eksperimen iki diulang kaping pindho kanthi asil sing padha.
Mulane, sabanjure kita nyelidiki korelasi antarane sinyal GA lan aktivitas pembelahan sel kanthi ngenali dinding sel sing mentas kawangun sajrone uji coba (Gambar 5e). Pendekatan iki ngidini kita ngukur frekuensi lan arah pembelahan sel. Sing nggumunake, kita nemokake yen frekuensi pembelahan sel ing IPR lan SAM liyane (non-IPR, Gambar 5f) padha, nuduhake yen bedane sinyal GA antarane sel IPR lan non-IPR ora mengaruhi pembelahan sel kanthi signifikan. Iki, lan korelasi positif antarane sinyal GA lan anisotropi pertumbuhan, nyebabake kita nimbang apa aktivitas sinyal GA bisa mengaruhi orientasi bidang pembelahan sel. Kita ngukur orientasi dinding sel anyar minangka sudut lancip relatif marang sumbu radial sing nyambungake pusat meristem lan pusat dinding sel anyar (Gambar 5e-i) lan mirsani kecenderungan sing jelas kanggo sel kanggo mbagi ing sudut cedhak 90° relatif marang sumbu radial, kanthi frekuensi paling dhuwur diamati ing 70–80° (23,28%) lan 80–90° (22,62%) (Gambar 5e,i), sing cocog karo pambagian sel ing arah melingkar/transversal (Gambar 5h). Kanggo mriksa kontribusi sinyal GA kanggo prilaku pambagian sel iki, kita nganalisa parameter pambagian sel ing IPR lan non-IPR kanthi kapisah (Gambar 5i). Kita mirsani manawa distribusi sudut divisi ing sel IPR beda karo sel non-IPR utawa ing sel ing kabeh SAM, kanthi sel IPR nuduhake proporsi divisi sel lateral/bunder sing luwih dhuwur, yaiku, 70-80° lan 80-90° (33,86% lan 30,71%, proporsi sing cocog) (Gambar 5i). Dadi, pengamatan kita nuduhake hubungan antarane sinyal GA sing dhuwur lan orientasi bidang divisi sel sing cedhak karo arah sirkumferensial, padha karo korelasi antarane aktivitas sinyal GA lan anisotropi pertumbuhan (Gambar 5c, d). Kanggo luwih netepake konservasi spasial saka asosiasi iki, kita ngukur orientasi bidang divisi ing sel IPR sing ngubengi primordium wiwit saka P3, amarga aktivitas sinyal GA paling dhuwur dideteksi ing wilayah iki wiwit saka P4 (Gambar 4). Sudut divisi IPR sekitar P3 lan P4 ora nuduhake beda sing signifikan sacara statistik, sanajan frekuensi divisi sel lateral sing tambah akeh diamati ing IPR sekitar P4 (Gambar 5j). Nanging, ing sel IPR sekitar P5, bedane orientasi bidang divisi sel dadi signifikan sacara statistik, kanthi peningkatan frekuensi divisi sel transversal sing tajem (Gambar 5j). Bebarengan, asil kasebut nuduhake yen sinyal GA bisa ngontrol orientasi divisi sel ing SAM, sing konsisten karo laporan sadurunge40,41 yen sinyal GA sing dhuwur bisa nyebabake orientasi lateral divisi sel ing IPR.
Diprediksi yen sel ing IPR ora bakal digabungake menyang primordia nanging luwih menyang internode2,42,43. Orientasi transversal saka divisi sel ing IPR bisa nyebabake organisasi khas baris longitudinal paralel sel epidermal ing internode. Pengamatan kita sing diterangake ing ndhuwur nuduhake yen sinyal GA kemungkinan nduweni peran ing proses iki kanthi ngatur arah divisi sel.
Ilange fungsi sawetara gen DELLA nyebabake respon GA konstitutif, lan mutan della bisa digunakake kanggo nguji hipotesis iki44. Kita pisanan nganalisa pola ekspresi limang gen DELLA ing SAM. Fusi transkripsi saka garis GUS45 nuduhake yen GAI, RGA, RGL1, lan RGL2 (kanthi tingkat sing luwih sithik) diekspresikan ing SAM (Gambar Tambahan 11a–d). Hibridisasi in situ luwih lanjut nuduhake yen mRNA GAI nglumpuk khusus ing primordia lan kembang sing lagi berkembang (Gambar Tambahan 11e). MRNA RGL1 lan RGL3 dideteksi ing saindenging kanopi SAM lan ing kembang sing luwih tuwa, dene mRNA RGL2 luwih akeh ing wilayah wates (Gambar Tambahan 11f–h). Pencitraan confocal pRGL3::RGL3-GFP SAM ngonfirmasi ekspresi sing diamati dening hibridisasi in situ lan nuduhake yen protein RGL3 nglumpuk ing bagean tengah SAM (Gambar Tambahan 11i). Nggunakake garis pRGA::GFP-RGA, kita uga nemokake manawa protein RGA nglumpuk ing SAM, nanging kelimpahane mudhun ing wates wiwit saka P4 (Gambar Tambahan 11j). Khususé, pola ekspresi RGL3 lan RGA konsisten karo aktivitas sinyal GA sing luwih dhuwur ing IPR, kaya sing dideteksi dening qmRGA (Gambar 4). Kajaba iku, data kasebut nuduhake manawa kabeh DELLA diekspresikan ing SAM lan ekspresi kasebut sacara kolektif nyakup kabeh SAM.
Sabanjure, kita nganalisa parameter divisi sel ing SAM tipe liar (Ler, kontrol) lan mutan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Gambar 6a, b). Menariknya, kita mirsani owah-owahan sing signifikan sacara statistik ing distribusi frekuensi sudut divisi sel ing SAM mutan della global dibandhingake karo tipe liar (Gambar 6c). Owah-owahan ing mutan della global iki amarga peningkatan frekuensi sudut 80-90° (34,71% vs 24,55%) lan, ing tingkat sing luwih murah, sudut 70-80° (23,78% vs 20,18%), yaiku, cocog karo divisi sel transversal (Gambar 6c). Frekuensi divisi non-transversal (0-60°) uga luwih murah ing mutan della global (Gambar 6c). Frekuensi divisi sel transversal tambah akeh ing SAM saka mutan della global (Gambar 6b). Frekuensi pambagian sel transversal ing IPR uga luwih dhuwur ing mutan della global dibandhingake karo tipe liar (Gambar 6d). Ing njaba wilayah IPR, tipe liar nduweni distribusi sudut pambagian sel sing luwih seragam, dene mutan della global luwih seneng pambagian tangensial kaya IPR (Gambar 6e). Kita uga ngukur orientasi pambagian sel ing SAM saka mutan kuintuple ga2 oksidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, lan ga2ox6-2), latar mburi mutan sing ora aktif GA ing ngendi GA nglumpuk. Konsisten karo paningkatan tingkat GA, SAM saka infloresensi mutan quintuple ga2ox luwih gedhe tinimbang Col-0 (Gambar Tambahan 12a, b), lan dibandhingake karo Col-0, SAM quintuple ga2ox nuduhake distribusi sudut pembelahan sel sing beda banget, kanthi frekuensi sudut mundhak saka 50° nganti 90°, yaiku maneh luwih seneng divisi tangensial (Gambar Tambahan 12a–c). Dadi, kita nuduhake yen aktivasi konstitutif saka sinyal GA lan akumulasi GA nyebabake divisi sel lateral ing IPR lan SAM liyane.
a, b Visualisasi 3D lapisan L1 saka Ler (a) lan mutan della global (b) sing diwarnai PI nggunakake mikroskop confocal. Dinding sel anyar sing kawangun ing SAM (nanging dudu primordium) sajrone periode 10 jam dituduhake lan diwarnai miturut nilai sudut. Sisipan nuduhake SAM ing 0 jam. Bilah warna ditampilake ing pojok tengen ngisor. Panah ing (b) nuduhake conto file sel sing sejajar ing mutan della global. Eksperimen iki diulang kaping pindho kanthi asil sing padha. perbandingan distribusi frekuensi orientasi bidang divisi sel ing kabeh SAM (d), IPR (e), lan non-IPR (f) antarane Ler lan della global. Nilai P dipikolehi nggunakake tes Kolmogorov-Smirnov rong sisi. f, g Visualisasi 3D gambar confocal saka SAM sing diwarnai PI saka tanduran transgenik Col-0 (i) lan pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panel (a, b) nuduhake dinding sel anyar (nanging dudu primordia) sing kawangun ing SAM sajrone 10 jam. Eksperimen iki diulang kaping pindho kanthi asil sing padha. h–j Perbandingan distribusi frekuensi orientasi bidang divisi sel sing dumunung ing kabeh SAM (h), IPR (i) lan non-IPR (j) antarane tanduran Col-0 lan pCUC2::gai-1-VENUS. Nilai P dipikolehi nggunakake tes Kolmogorov-Smirnov rong sisi.
Sabanjure, kita nguji efek saka inhibisi sinyal GA khusus ing IP R. Kanggo tujuan iki, kita nggunakake promotor cotyledon cup 2 (CUC2) kanggo ndorong ekspresi protein gai-1 negatif dominan sing digabungake karo VENUS (ing garis pCUC2::gai-1-VENUS). Ing SAM tipe liar, promotor CUC2 ndorong ekspresi sebagian besar IP R ing SAM, kalebu sel wates, saka P4 terus, lan ekspresi spesifik sing padha diamati ing tanduran pCUC2::gai-1-VENUS (deleng ing ngisor iki). Distribusi sudut pembelahan sel ing SAM utawa IP R tanduran pCUC2::gai-1-VENUS ora beda banget karo jinis liar, sanajan tanpa diduga kita nemokake yen sel tanpa IP R ing tanduran kasebut dibagi kanthi frekuensi sing luwih dhuwur yaiku 80-90° (Gambar 6f-j).
Wis ana sing ngusulake yen arah pembelahan sel gumantung saka geometri SAM, utamane tegangan tarik sing diasilake dening kelengkungan jaringan46. Mula, kita takon apa bentuk SAM diganti ing mutan della global lan tanduran pCUC2::gai-1-VENUS. Kaya sing dilapurake sadurunge12, ukuran mutan della global SAM luwih gedhe tinimbang jinis liar (Gambar Tambahan 13a, b, d). Hibridisasi in situ CLV3 lan STM RNA ngonfirmasi ekspansi meristem ing mutan della lan luwih nuduhake ekspansi lateral saka niche sel punca (Gambar Tambahan 13e, f, h, i). Nanging, kelengkungan SAM padha ing loro genotipe (Gambar Tambahan 13k, m, n, p). Kita mirsani peningkatan ukuran sing padha ing mutan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple tanpa owah-owahan kelengkungan dibandhingake karo jinis liar (Gambar Tambahan 13c, d, g, j, l, o, p). Frekuensi orientasi pembelahan sel uga kena pengaruh ing mutan della quadruple, nanging luwih sithik tinimbang ing mutan della monolitik (Gambar Tambahan 12d–f). Efek dosis iki, bebarengan karo ora ana efek ing kelengkungan, nuduhake yen aktivitas RGL3 residual ing mutan Della quadruple mbatesi owah-owahan ing orientasi pembelahan sel sing disebabake dening ilang aktivitas DELLA lan owah-owahan ing pembelahan sel lateral kedadeyan minangka respon kanggo owah-owahan ing aktivitas sinyal GA tinimbang owah-owahan ing geometri SAM. Kaya sing diterangake ing ndhuwur, promotor CUC2 ndorong ekspresi IP R ing SAM sing diwiwiti saka P4 (Gambar Tambahan 14a, b), lan kosok baline, SAM pCUC2::gai-1-VENUS duwe ukuran sing luwih cilik nanging kelengkungan sing luwih dhuwur (Gambar Tambahan 14c–h). Owah-owahan ing morfologi SAM pCUC2::gai-1-VENUS iki bisa nyebabake distribusi tekanan mekanik sing beda dibandhingake karo jinis liar, ing ngendi tekanan sirkumferensial sing dhuwur diwiwiti ing jarak sing luwih cendhek saka pusat SAM47. Utawa, owah-owahan ing morfologi pCUC2::gai-1-VENUS SAM bisa uga disebabake owah-owahan ing sifat mekanik regional sing disebabake dening ekspresi transgen48. Ing loro kasus kasebut, iki bisa ngimbangi sebagian efek saka owah-owahan ing sinyal GA kanthi nambah kemungkinan sel bakal dibagi ing orientasi sirkumferensial/transversal, sing nerangake pengamatan kita.
Yen digabungake, data kita ngonfirmasi manawa sinyal GA sing luwih dhuwur nduweni peran aktif ing orientasi lateral bidang pembelahan sel ing IPR. Data kasebut uga nuduhake manawa kelengkungan meristem uga mengaruhi orientasi bidang pembelahan sel ing IPR.
Orientasi transversal saka bidang divisi ing IPR, amarga aktivitas sinyal GA sing dhuwur, nuduhake yen GA ngatur file sel radial ing epidermis ing SAM kanggo nemtokake organisasi seluler sing mengko bakal ditemokake ing internode epidermal. Pancen, file sel kasebut asring katon ing gambar SAM saka mutan della global (Gambar 6b). Dadi, kanggo luwih njelajah fungsi perkembangan pola spasial sinyal GA ing SAM, kita nggunakake pencitraan selang wektu kanggo nganalisis organisasi spasial sel ing IPR ing tipe liar (Ler lan Col-0), mutan della global, lan tanduran transgenik pCUC2::gai-1-VENUS.
Kita nemokake yen qmRGA nuduhake yen aktivitas sinyal GA ing IPR mundhak saka P1/P2 lan puncak ing P4, lan pola iki tetep konstan sajrone wektu (Gambar 4a-f lan Gambar Tambahan 8c-f, k). Kanggo nganalisis organisasi spasial sel ing IPR kanthi sinyal GA sing saya tambah, kita menehi label sel Ler IPR ing ndhuwur lan ing sisih P4 miturut nasib perkembangan sing dianalisis 34 jam sawise pengamatan pertama, yaiku, luwih saka rong wektu plastid, sing ngidini kita ngetutake sel IPR sajrone perkembangan primordium saka P1/P2 nganti P4. Kita nggunakake telung warna sing beda: kuning kanggo sel sing diintegrasi menyang primordium cedhak P4, ijo kanggo sing ana ing IPR, lan ungu kanggo sing melu ing loro proses kasebut (Gambar 7a-c). Ing t0 (0 jam), 1-2 lapisan sel IPR katon ing ngarep P4 (Gambar 7a). Kaya sing dikarepake, nalika sel kasebut dibagi, utamane liwat bidang divisi transversal (Gambar 7a-c). Asil sing padha dipikolehi nggunakake Col-0 SAM (fokus ing P3, sing watese lipatan padha karo P4 ing Ler), sanajan ing genotipe iki lipatan sing dibentuk ing wates kembang ndhelikake sel IPR luwih cepet (Gambar 7g–i). Mangkono, pola divisi sel IPR ngatur sel kasebut dadi baris radial, kaya ing internode. Organisasi baris radial lan lokalisasi sel IPR antarane organ sing berturut-turut nuduhake yen sel kasebut minangka progenitor internodal.
Ing kene, kita ngembangake biosensor sinyal GA rasiometrik, qmRGA, sing ngidini pemetaan kuantitatif aktivitas sinyal GA sing diasilake saka konsentrasi reseptor GA lan GA gabungan nalika nyuda gangguan karo jalur sinyal endogen, saengga nyedhiyakake informasi babagan fungsi GA ing tingkat seluler. Kanggo tujuan iki, kita nggawe protein DELLA sing dimodifikasi, mRGA, sing wis ilang kemampuan kanggo ngiket mitra interaksi DELLA nanging tetep sensitif marang proteolisis sing diinduksi GA. qmRGA nanggapi owah-owahan eksogen lan endogen ing tingkat GA, lan sifat penginderaan dinamis ngaktifake penilaian owah-owahan spatiotemporal ing aktivitas sinyal GA sajrone pangembangan. qmRGA uga minangka alat sing fleksibel banget amarga bisa diadaptasi menyang jaringan sing beda-beda kanthi ngganti promotor sing digunakake kanggo ekspresine (yen perlu), lan diwenehi sifat jalur sinyal GA sing dilestarikake lan motif PFYRE ing angiospermae, kemungkinan bisa ditransfer menyang spesies liyane22. Konsisten karo iki, mutasi sing padha ing protein beras SLR1 DELLA (HYY497AAA) uga dituduhake bisa nyuda aktivitas represor pertumbuhan SLR1 nalika mung rada nyuda degradasi sing dimediasi GA, padha karo mRGA23. Khususé, panliten anyar ing Arabidopsis nuduhake yen mutasi asam amino tunggal ing domain PFYRE (S474L) ngowahi aktivitas transkripsi RGA tanpa mengaruhi kemampuane kanggo sesambungan karo mitra faktor transkripsi50. Sanajan mutasi iki cedhak banget karo 3 substitusi asam amino sing ana ing mRGA, panliten kita nuduhake yen rong mutasi iki ngowahi karakteristik DELLA sing béda. Sanajan umume mitra faktor transkripsi kaiket karo domain LHR1 lan SAW saka DELLA26,51, sawetara asam amino sing dilestarikake ing domain PFYRE bisa mbantu nyetabilake interaksi kasebut.
Pangembangan ruas minangka sipat kunci ing arsitektur tanduran lan peningkatan panen. qmRGA nuduhake aktivitas sinyal GA sing luwih dhuwur ing sel progenitor ruas IP R. Kanthi nggabungake pencitraan kuantitatif lan genetika, kita nuduhake manawa pola sinyal GA tumpang tindih bidang divisi sel bunder/transversal ing epidermis SAM, mbentuk organisasi divisi sel sing dibutuhake kanggo pangembangan ruas. Sawetara regulator orientasi bidang divisi sel wis diidentifikasi sajrone pangembangan52,53. Karya kita menehi conto sing jelas babagan kepiye aktivitas sinyal GA ngatur parameter seluler iki. DELLA bisa sesambungan karo kompleks protein prefolding41, saengga sinyal GA bisa ngatur orientasi bidang divisi sel kanthi langsung mengaruhi orientasi mikrotubulus kortikal40,41,54,55. Kita ora sengaja nuduhake manawa ing SAM, korelasi aktivitas sinyal GA sing luwih dhuwur dudu pemanjangan utawa divisi sel, nanging mung anisotropi pertumbuhan, sing konsisten karo efek langsung GA ing arah divisi sel ing IP R. Nanging, kita ora bisa ngilangi manawa efek iki uga bisa ora langsung, contone dimediasi dening pelunakan dinding sel sing diinduksi GA56. Owah-owahan ing sipat dinding sel nyebabake stres mekanik57,58, sing uga bisa mengaruhi orientasi bidang divisi sel kanthi mengaruhi orientasi mikrotubulus kortikal39,46,59. Efek gabungan saka stres mekanik sing diinduksi GA lan regulasi langsung orientasi mikrotubulus dening GA bisa uga melu ngasilake pola orientasi divisi sel tartamtu ing IPR kanggo nemtokake internode, lan panliten luwih lanjut dibutuhake kanggo nguji ide iki. Kajaba iku, panliten sadurunge wis nyoroti pentinge protein sing berinteraksi karo DELLA TCP14 lan 15 ing kontrol pembentukan internode60,61 lan faktor-faktor kasebut bisa dadi mediator aksi GA bebarengan karo BREVIPEDICELLUS (BP) lan PENNYWISE (PNY), sing ngatur perkembangan internode lan wis dituduhake mengaruhi sinyal GA2,62. Amarga DELLA berinteraksi karo jalur sinyal brassinosteroid, etilena, asam jasmonat, lan asam absisat (ABA)63,64 lan hormon kasebut bisa mengaruhi orientasi mikrotubulus65, efek GA ing orientasi divisi sel uga bisa dimediasi dening hormon liyane.
Panliten sitologi awal nuduhake yen wilayah njero lan njaba saka Arabidopsis SAM dibutuhake kanggo perkembangan internode2,42. Kasunyatan manawa GA aktif ngatur pembelahan sel ing jaringan njero12 ndhukung fungsi ganda GA kanggo ngatur ukuran meristem lan internode ing SAM. Pola pembelahan sel arah uga diatur kanthi rapet ing jaringan SAM njero, lan peraturan iki penting kanggo pertumbuhan batang52. Bakal menarik kanggo mriksa apa GA uga nduweni peran ing orientasi bidang pembelahan sel ing organisasi SAM njero, saengga nyelarasake spesifikasi lan perkembangan internode ing SAM.
Tanduran ditandur in vitro ing lemah utawa 1x medium Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) sing ditambah karo 1% sukrosa lan 1% agar (Sigma) ing kahanan standar (cahya 16 jam, 22 °C), kajaba kanggo eksperimen hipokotil lan pertumbuhan oyot ing ngendi tunas ditandur ing piring vertikal ing cahya konstan lan 22 °C. Kanggo eksperimen nitrat, tanduran ditandur ing medium MS sing dimodifikasi (media tanduran bioWORLD) sing ditambah karo nitrat sing cukup (0 utawa 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suksinat, 1% sukrosa lan 1% A-agar (Sigma) ing kahanan dina dawa.
cDNA GID1a sing dilebokake ing pDONR221 digabungake maneh karo pDONR P4-P1R-pUBQ10 lan pDONR P2R-P3-mCherry menyang pB7m34GW kanggo ngasilake pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 sing dilebokake ing pDONR221 digabungake maneh menyang pB7RWG266 kanggo ngasilake p35S:IDD2-RFP. Kanggo ngasilake pGID1b::2xmTQ2-GID1b, fragmen 3,9 kb ing sisih ndhuwur wilayah kode GID1b lan fragmen 4,7 kb sing ngemot cDNA GID1b (1,3 kb) lan terminator (3,4 kb) dhisik diamplifikasi nggunakake primer ing Tabel Tambahan 3 banjur dilebokake ing pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) lan pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), lan pungkasane digabungake maneh karo pDONR221 2xmTQ268 menyang vektor target pGreen 012567 nggunakake kloning Gateway. Kanggo ngasilake pCUC2::LSSmOrange, urutan promotor CUC2 (3229 bp ing sisih ndhuwur ATG) banjur diterusake karo urutan kode mOrange sing digeser Stokes gedhe (LSSmOrange)69 kanthi sinyal lokalisasi nuklir N7 lan terminator transkripsi NOS dirakit menyang vektor penargetan kanamycin pGreen nggunakake sistem rekombinasi fragmen Gateway 3 (Invitrogen). Vektor biner tanduran dikenalake menyang Agrobacterium tumefaciens galur GV3101 lan dikenalake menyang godhong Nicotiana benthamiana kanthi metode infiltrasi Agrobacterium lan menyang Arabidopsis thaliana Col-0 kanthi metode celup kembang. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry lan pCLV3::mCherry-NLS qmRGA diisolasi saka progeni F3 lan F1 saka persilangan masing-masing.
Hibridisasi in situ RNA ditindakake ing pucuk tunas sing dawane kira-kira 1 cm72, sing dikumpulake lan langsung difiksasi ing larutan FAA (3,7% formaldehida, 5% asam asetat, 50% etanol) sing wis didinginkan nganti 4 °C. Sawise perawatan vakum 2 × 15 menit, fiksatif diganti lan sampel diinkubasi sewengi. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, lan RGL3 lan probe antisense menyang 3′-UTR disintesis nggunakake primer sing dituduhake ing Tabel Tambahan 3 kaya sing diterangake dening Rosier et al.73. Probe sing diwenehi label Digoxigenin dideteksi sacara imun nggunakake antibodi digoxigenin (pengenceran 3000 kali lipat; Roche, nomer katalog: 11 093 274 910), lan bagean-bagean kasebut diwernani nganggo larutan 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP, pengenceran 250 kali lipat)/nitroblue tetrazolium (NBT, pengenceran 200 kali lipat).
Wektu kiriman: 10-Feb-2025