Nematoda pinus minangka endoparasit migrasi karantina sing dikenal nyebabake kerugian ekonomi sing abot ing ekosistem alas pinus. Panliten iki nyinaoni aktivitas nematicidal saka indoles halogenated marang nematoda pinus lan mekanisme tumindake. Aktivitas nematicidal saka 5-iodoindole lan avermectin (kontrol positif) marang nematoda pinus padha lan dhuwur ing konsentrasi kurang (10 μg / mL). 5-iodoindole ngurangi fekunditas, aktivitas reproduksi, kematian embrio lan larva, lan prilaku lokomotor. Interaksi molekuler ligan karo reseptor saluran klorida glutamat sing spesifik invertebrata ndhukung gagasan yen 5-iodoindole, kaya avermectin, ngiket kanthi kenceng menyang situs aktif reseptor. 5-Iodoindole uga nyebabake macem-macem deformasi fenotipik ing nematoda, kalebu ambruk / penyusutan organ sing ora normal lan nambah vakuolisasi. Asil kasebut nuduhake yen vakuola bisa uga duwe peran ing pati sing dimediasi metilasi nematoda. Sing penting, 5-iodoindole ora beracun kanggo spesies tanduran (kubis lan lobak). Dadi, panliten iki nuduhake yen aplikasi iodoindole ing kahanan lingkungan bisa ngontrol cedera layu pinus.
Nematoda kayu pinus (Bursaphelenchus xylophilus) kalebu nematoda kayu pinus (PWN), nematoda endoparasitik migrasi sing dikenal nyebabake karusakan ekologis sing abot kanggo ekosistem alas pinus1. Penyakit layu pinus (PWD) sing disebabake dening nematoda kayu pinus dadi masalah serius ing sawetara bawana, kalebu Asia lan Eropa, lan ing Amerika Utara, nematoda ngrusak spesies pinus sing dikenalake1,2. Kurangé wit pinus minangka masalah ékonomi sing gedhé, lan prospek panyebaran globalé kuwatir3. Spesies pinus ing ngisor iki sing paling kerep diserang dening nematoda: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, lan Pinus radiata4. Nematoda pinus minangka penyakit serius sing bisa mateni wit cemara sajrone sawetara minggu utawa wulan infeksi. Kajaba iku, wabah nematoda pinus umum ing macem-macem ekosistem, mula rantai infeksi terus-terusan wis ditetepake1.
Bursaphelenchus xylophilus minangka nematoda parasit-parasit karantina sing kagolong ing superfamili Aphelenchoidea lan clade 102.5. Nematoda mangan jamur lan reproduksi ing jaringan kayu wit pinus, berkembang dadi papat tahap larva sing beda: L1, L2, L3, L4 lan individu diwasa1,6. Ing kahanan kekurangan pangan, nematoda pinus ngliwati tahap larva khusus - dauer, sing parasitizes vektor - kumbang kulit pinus (Monochamus alternatus) lan ditransfer menyang wit pinus sing sehat. Ing sarwa sehat, nematoda cepet migrasi liwat jaringan tanduran lan mangan sel parenchymatous, sing ndadékaké sawetara reaksi hipersensitivitas, wilting pinus lan mati ing setahun sawise infeksi1,7,8.
Kontrol biologi nematoda pinus wis suwe dadi tantangan, kanthi langkah karantina wiwit abad kaping 20. Sastranegara saiki kanggo ngontrol nematoda pinus utamane nglibatake perawatan kimia, kalebu fumigasi kayu lan implantasi nematisida menyang batang wit. Nematicides sing paling umum digunakake yaiku avermectin lan avermectin benzoate, sing kalebu kulawarga avermectin. Bahan kimia sing larang iki efektif banget nglawan akeh spesies nematoda lan dianggep aman kanggo lingkungan9. Nanging, bola-bali nggunakake nematicides iki samesthine kanggo nggawe tekanan pilihan sing meh mesthi bakal mimpin kanggo munculé nematoda pinus tahan, kaya sing wis dituduhake kanggo sawetara omo serangga, kayata Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella lan nematodes Trichostrongylus colubriformis lan Ostertagia circumcincta, kang wis resistance bertahap. avermectins10,11,12. Mula, pola resistensi kudu ditliti kanthi rutin lan nematisida terus disaring kanggo nemokake langkah alternatif, biaya-efektif lan ramah lingkungan kanggo ngontrol PVD. Ing dekade anyar, sawetara penulis wis ngajokaken nggunakake ekstrak tanduran, lenga atsiri lan volatiles minangka agen kontrol nematode13,14,15,16.
Kita bubar nuduhake aktivitas nematicidal saka indole, molekul sinyal intercellular lan interkingdom, ing Caenorhabditis elegans 17. Indole minangka sinyal intraselular sing nyebar ing ekologi mikroba, ngontrol akeh fungsi sing mengaruhi fisiologi mikroba, pembentukan spora, stabilitas plasmid, resistensi obat, pembentukan biofilm, lan virulensi 18, 19. Aktivitas indole lan turunane marang nematoda patogen liyane durung diteliti. Ing panliten iki, kita nyelidiki aktivitas nematicidal saka 34 indole marang nematoda pinus lan njlentrehake mekanisme aksi 5-iodoindole sing paling kuat nggunakake mikroskop, fotografi time-lapse, lan eksperimen docking molekuler, lan ngevaluasi efek beracun ing tanduran nggunakake tes germination wiji.
Konsentrasi dhuwur (> 1.0 mM) saka indole wis dilapurake sadurunge duwe efek nematicidal ing nematoda17. Sawise perawatan B. xylophilus (tataran urip campuran) karo indole utawa 33 turunan indole beda ing 1 mM, mortalitas saka B. xylophilus diukur kanthi ngitung nematoda urip lan mati ing kelompok kontrol lan dianggep. Lima indole nuduhake aktivitas nematicidal sing signifikan; kaslametané klompok kontrol sing ora diobati yaiku 95 ± 7% sawise 24 jam. Saka 34 indole sing diuji, 5-iodoindole lan 4-fluoroindole ing 1 mM nyebabake kematian 100%, dene 5,6-difluoroindigo, methylindole-7-karboksilat, lan 7-iodoindole nyebabake 50% kematian (Tabel 1).
Pengaruh 5-iodoindole ing pambentukan vakuola lan metabolisme nematoda kayu pinus. (A) Pengaruh avermectin lan 5-iodoindole ing nematoda lanang diwasa, (B) endhog nematoda tahap L1 lan (C) metabolisme B. xylophilus, (i) vakuola ora diamati ing 0 h, perawatan nyebabake (ii) vakuola, (iii) akumulasi pirang-pirang vakuola, (iv) fusions saka vakuola, (iv) fusions (vi) pembentukan vakuola raksasa. Panah abang nuduhake pembengkakan vakuola, panah biru nuduhake fusi vakuola lan panah ireng nuduhake vakuola raksasa. Skala bar = 50 μm.
Saliyané iku, panliten iki uga njlèntrèhaké prosès sekuensial pati sing diakibataké déning metana ing nematoda pinus (Gambar 4C). Pati metanogenik minangka jinis mati sel sing ora apoptosis sing ana gandhengane karo akumulasi vakuola sitoplasma sing penting27. Cacat morfologis sing diamati ing nematoda pinus katon raket banget karo mekanisme kematian akibat metana. Pemeriksaan mikroskopik ing wektu sing beda-beda nuduhake yen vakuola raksasa dibentuk sawise 20 jam paparan 5-iodoindole (0,1 mM). Vakuola mikroskopik diamati sawise 8 jam perawatan, lan jumlahe tambah sawise 12 jam. Sawetara vakuola gedhe diamati sawise 14 jam. Sawetara vakuola sing digabung katon jelas sawise 12-16 jam perawatan, nuduhake yen fusi vakuola minangka basis mekanisme pati metanogenik. Sawise 20 jam, sawetara vakuola raksasa ditemokake ing saindhenging cacing. Observasi kasebut minangka laporan metuosis pisanan ing C. elegans.
Ing cacing sing diobati 5-iodoindole, agregasi lan pecah vakuola uga diamati (Gambar 5), sing dibuktekake kanthi mlengkung cacing lan ngeculake vakuola menyang lingkungan. Gangguan vakuola uga diamati ing membran cangkang endhog, sing biasane diawetake kanthi utuh dening L2 sajrone penetasan (Tambahan Gambar S2). Observasi kasebut ndhukung keterlibatan akumulasi cairan lan kegagalan osmoregulatory, uga cedera sel sing bisa dibalik (RCI), ing proses pembentukan lan suppuration vakuola (Gambar 5).
Hypothesizing peran yodium ing pambentukan vakuola sing diamati, kita nyelidiki aktivitas nematicidal sodium iodide (NaI) lan kalium iodide (KI). Nanging, ing konsentrasi (0.1, 0.5 utawa 1 mM), padha ora mengaruhi kaslametané nematoda utawa vakuola formasi (Tambahan Gambar. S5), sanajan 1 mM KI duwe efek nematicidal tipis. Ing sisih liya, 7-iodoindole (1 utawa 2 mM), kaya 5-iodoindole, nyebabake macem-macem vakuola lan deformasi struktural (Tambahan Gambar S6). Kaloro iodoindoles nuduhake karakteristik fenotipik sing padha ing nematoda pinus, dene NaI lan KI ora. Apike, indole ora nyebabake pembentukan vakuola ing B. xylophilus ing konsentrasi sing diuji (data ora ditampilake). Mangkono, asil dikonfirmasi manawa kompleks indole-iodine tanggung jawab kanggo vakuolisasi lan metabolisme B. xylophilus.
Ing antarane indole sing diuji aktivitas nematicidal, 5-iodoindole nduweni indeks slip paling dhuwur yaiku -5,89 kkal/mol, banjur 7-iodoindole (-4,48 kkal/mol), 4-fluoroindole (-4,33), lan indole (-4,03) (Gambar 6). Ikatan hidrogen balung mburi sing kuwat saka 5-iodoindole menyang leucine 218 nyetabilake ikatane, dene kabeh turunan indole liyane ngiket karo serine 260 liwat ikatan hidrogen rantai samping. Antarane iodoindoles model liyane, 2-iodoindole nduweni nilai pengikatan -5,248 kkal/mol, amarga ikatan hidrogen utama karo leucine 218. Ikatan liyane sing dikenal kalebu 3-iodoindole (-4,3 kkal/mol), 4-iodokalkal/mol (-4,0 kkal/mol), lan (6-2. S8). Umume indole lan indole halogenasi dhewe, kajaba 5-iodoindole lan 2-iodoindole, mbentuk ikatan karo serine 260. Kasunyatan yen ikatan hidrogen karo leucine 218 nuduhake ikatan reseptor-ligan sing efisien, kaya sing diamati kanggo ivermectin (Tambahan Gambar S7), negesake manawa 5-iodole, indole, lan iodole, kaya 5-iodole. ikatan rapet menyang situs aktif reseptor GluCL liwat leucine 218 (Gambar 6 lan Gambar Tambahan S8). Kita ngusulake manawa ikatan iki dibutuhake kanggo njaga struktur pori mbukak kompleks GluCL lan kanthi naleni kanthi rapet menyang situs aktif reseptor GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin lan ivermectin saéngga njaga saluran ion mbukak lan ngidini penyerapan cairan.
Docking molekul saka indole lan indole halogenated kanggo GluCL. Orientasi ikatan (A) indole, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole, lan (D) ligan 5-iodoindole menyang situs aktif GluCL. Protein diwakili dening pita, lan ikatan hidrogen balung mburi ditampilake minangka garis titik kuning. (A′), (B′), (C′), lan (D′) nuduhake interaksi ligan sing cocog karo residu asam amino ing saubengé, lan ikatan hidrogen rantai sisih dituduhake kanthi panah titik jambon.
Eksperimen ditindakake kanggo ngevaluasi efek beracun 5-iodoindole ing germination saka wiji kubis lan lobak. 5-iodoindole (0,05 utawa 0,1 mM) utawa avermectin (10 μg / mL) duweni pengaruh sethithik utawa ora ana ing germination awal lan munculé plantlet (Gambar 7). Kajaba iku, ora ana prabédan sing signifikan ing antarane tingkat germinasi kontrol sing ora diobati lan wiji sing diolah nganggo 5-iodoindole utawa avermectin. Efek ing elongasi taproot lan jumlah akar lateral sing dibentuk ora pati penting, sanajan 1 mM (10 kaping konsentrasi aktif) saka 5-iodoindole rada tundha pangembangan akar lateral. Asil kasebut nuduhake yen 5-iodoindole ora beracun kanggo sel tanduran lan ora ngganggu proses pangembangan tanduran ing konsentrasi sing ditliti.
Pengaruh 5-iodoindole ing germination wiji. Germination, sprouting lan rooting lateral wiji B. oleracea lan R. raphanistrum ing medium Murashige lan Skoog agar kanthi utawa tanpa avermectin utawa 5-iodoindole. Germinasi dicathet sawise 3 dina inkubasi ing 22 ° C.
Panliten iki nglaporake sawetara kasus pembunuhan nematoda dening indole. Sing penting, iki laporan pisanan saka iodoindole inducing methylation (prosès sing disebabake akumulasi vakuola cilik sing mboko sithik dadi vakuola raksasa, sing pungkasane nyebabake pecah membran lan pati) ing jarum pinus, kanthi iodoindole nuduhake sifat nematicidal sing padha karo nematisida komersial avermectin.
Indoles wis dilapurake sadurunge nindakake macem-macem fungsi sinyal ing prokariota lan eukariota, kalebu inhibisi / pembentukan biofilm, kaslametan bakteri, lan patogenisitas19,32,33,34. Bubar, efek terapeutik potensial saka indole halogenated, alkaloid indole, lan turunan indole semisintetik wis narik minat riset ekstensif35,36,37. Contone, indole halogenasi wis dituduhake bisa mateni Escherichia coli lan sel Staphylococcus aureus sing terus-terusan37. Kajaba iku, kapentingan ilmiah kanggo nyinaoni khasiat indole halogenasi marang spesies, genera, lan kerajaan liyane, lan panliten iki minangka langkah kanggo nggayuh tujuan kasebut.
Ing kene, kita ngusulake mekanisme kanggo lethality 5-iodoindole-induced ing C. elegans adhedhasar cedera sel sing bisa dibalik (RCI) lan metilasi (Gambar 4C lan 5). Owah-owahan edema kayata puffiness lan degenerasi vakuolar minangka indikator RCI lan metilasi, diwujudake minangka vakuola raksasa ing sitoplasma48,49. RCI ngganggu produksi energi kanthi ngurangi produksi ATP, nyebabake kegagalan pompa ATPase, utawa ngganggu membran sel lan nyebabake influx cepet saka Na +, Ca2 +, lan banyu50,51,52. Vakuola intracytoplasmic muncul ing sel kewan minangka akibat saka akumulasi cairan ing sitoplasma amarga influx Ca2+ lan banyu53. Sing nggumunake, mekanisme karusakan sel iki bisa dibalik yen karusakane sementara lan sel wiwit ngasilake ATP kanggo wektu tartamtu, nanging yen karusakan tetep utawa saya tambah parah, sel kasebut mati.54 Pengamatan kita nuduhake yen nematoda sing diobati karo 5-iodoindole ora bisa mulihake biosintesis normal sawise kena pengaruh kahanan stres.
Fenotipe metilasi sing disebabake dening 5-iodoindole ing B. xylophilus bisa uga amarga anané yodium lan distribusi molekul, amarga 7-iodoindole duweni efek inhibisi sing kurang ing B. xylophilus tinimbang 5-iodoindole (Tabel 1 lan Gambar Tambahan S6). Asil iki sebagian konsisten karo pasinaon Maltese et al. (2014), sing nglapurake yen translokasi saka pyridyl nitrogen moiety ing indole saka para- menyang meta-posisi ngilangi vakuolisasi, inhibisi wutah, lan sitotoksisitas ing sel U251, nuduhake yen interaksi molekul karo situs aktif tartamtu ing protein kritis27,44,45. Interaksi ing antarane indole utawa halogenated lan reseptor GluCL sing diamati ing panliten iki uga ndhukung gagasan iki, amarga 5- lan 2-iodoindole ditemokake kanggo ikatan karo reseptor GluCL luwih kuat tinimbang indole liyane sing diteliti (Gambar 6 lan Gambar Tambahan S8). Yodium ing posisi kaping pindho utawa kaping lima saka indole ditemokake kanggo ikatan karo leucine 218 saka reseptor GluCL liwat ikatan hidrogen backbone, dene indole lan indole halogenated liyane mbentuk ikatan hidrogen rantai sisih sing lemah karo serine 260 (Gambar 6). Mulane kita spekulasi yen lokalisasi halogen nduweni peran penting ing induksi degenerasi vakuolar, dene ikatan 5-iodoindole sing ketat tetep mbukak saluran ion, saéngga ngidini influx cairan kanthi cepet lan pecah vakuola. Nanging, mekanisme rinci tumindak 5-iodoindole tetep ditemtokake.
Sadurunge aplikasi praktis 5-iodoindole, efek beracun ing tanduran kudu dianalisis. Eksperimen germination wiji kita nuduhake yen 5-iodoindole ora duwe efek negatif marang germination wiji utawa proses pangembangan sakteruse ing konsentrasi sing ditliti (Gambar 7). Mangkono, panliten iki menehi dhasar kanggo nggunakake 5-iodoindole ing lingkungan ekologis kanggo ngontrol bahaya nematoda pinus marang wit cemara.
Laporan sadurunge wis nuduhake yen terapi adhedhasar indole nggambarake pendekatan potensial kanggo ngatasi masalah resistensi antibiotik lan progresi kanker55. Kajaba iku, indole nduweni aktivitas antibakteri, antikanker, antioksidan, anti-inflamasi, antidiabetik, antivirus, antiproliferatif lan antituberkulosis lan bisa uga dadi basis kanggo pangembangan obat56,57. Panliten iki nyaranake kanggo pisanan nggunakake potensial yodium minangka agen antiparasit lan anthelmintik.
Avermectin ditemokake telung puluh taun kepungkur lan menangake Bebungah Nobel ing taun 2015, lan panggunaane minangka anthelmintik isih aktif. Nanging, amarga pangembangan resistensi avermectins kanthi cepet ing nematoda lan hama serangga, strategi alternatif, murah, lan ramah lingkungan dibutuhake kanggo ngontrol infeksi PWN ing wit cemara. Panaliten iki uga nglaporake mekanisme 5-iodoindole mateni nematoda pinus lan 5-iodoindole nduweni keracunan sing sithik kanggo sel tanduran, sing mbukak prospek sing apik kanggo aplikasi komersial ing mangsa ngarep.
Kabeh eksperimen disetujoni dening Komite Etika Universitas Yeungnam, Gyeongsan, Korea, lan metode kasebut ditindakake miturut pedoman Komite Etika Universitas Yeungnam.
Eksperimen inkubasi endhog ditindakake nggunakake prosedur sing wis ditemtokake43. Kanggo netepake tingkat penetasan (HR), nematoda diwasa umur 1 dina (kira-kira 100 wadon lan 100 lanang) ditransfer menyang piring Petri sing ngemot jamur lan diidini tuwuh sajrone 24 jam. Endhog banjur diisolasi lan diolah nganggo 5-iodoindole (0,05 mM lan 0,1 mM) utawa avermectin (10 μg / ml) minangka suspensi ing banyu suling steril. Suspensi kasebut (500 μl; kira-kira 100 endhog) ditransfer menyang sumur saka piring kultur jaringan 24 sumur lan diinkubasi ing suhu 22 °C. Jumlah L2 digawe sawise 24 jam inkubasi nanging dianggep mati yen sel ora obah nalika dirangsang nganggo kabel platinum sing apik. Eksperimen iki ditindakake kanthi rong tahap, saben ana enem pengulangan. Data saka loro eksperimen kasebut digabungake lan ditampilake. Persentase HR diitung kaya ing ngisor iki:
Kematian larva ditaksir nggunakake prosedur sing wis dikembangake sadurunge. Endhog nematoda diklumpukake lan embrio disinkronake kanthi penetasan ing banyu suling steril kanggo ngasilake larva tahap L2. Larva sing disinkronake (kira-kira 500 nematoda) diobati nganggo 5-iodoindole (0,05 mM lan 0,1 mM) utawa avermectin (10 μg / ml) lan dibesarkan ing piring B. cinerea Petri. Sawise 48 jam inkubasi ing 22 ° C, nematoda diklumpukake ing banyu suling steril lan diteliti kanggo anané tahap L2, L3, lan L4. Anane tahap L3 lan L4 nuduhake transformasi larva, dene anane tahap L2 nuduhake ora ana transformasi. Gambar dipikolehi nggunakake Sistem Pencitraan Sel Digital iRiS™. Eksperimen iki ditindakake kanthi rong tahap, saben ana enem pengulangan. Data saka loro eksperimen kasebut digabungake lan ditampilake.
Toksisitas 5-iodoindole lan avermectin kanggo wiji ditaksir kanthi nggunakake tes germinasi ing piring agar Murashige lan Skoog.62 wiji B. oleracea lan R. raphanistrum pisanan direndhem ing banyu suling steril sajrone sedina, dicuci nganggo 1 ml 100% etanol, disterilisasi nganggo sodium chlorite 100% komersial, disterilisasi kanthi 1 ml sodium klorit 50% komersial. min, lan wisuh kaping lima karo 1 ml banyu steril. Wiji sing wis disteril banjur dipencet ing piring agar germination sing ngemot medium Murashige lan Skoog 0,86 g/l (0,2X) lan agar bakteriologis 0,7% kanthi utawa tanpa 5-iodoindole utawa avermectin. Piring kasebut banjur diinkubasi ing 22 ° C, lan gambar dijupuk sawise 3 dina inkubasi. Eksperimen iki ditindakake kanthi rong tahap, saben ana enem pengulangan.
Wektu kirim: Feb-26-2025