Nematoda pinus minangka endoparasit migrasi karantina sing dikenal nyebabake kerugian ekonomi sing parah ing ekosistem alas pinus. Panliten iki nliti aktivitas nematisida indol terhalogenasi nglawan nematoda pinus lan mekanisme aksine. Aktivitas nematisida 5-iodoindole lan avermectin (kontrol positif) nglawan nematoda pinus padha lan dhuwur ing konsentrasi sing endhek (10 μg/mL). 5-iodoindole nyuda fekunditas, aktivitas reproduksi, kematian embrio lan larva, lan perilaku lokomotor. Interaksi molekuler ligan karo reseptor saluran klorida berlapis glutamat spesifik invertebrata ndhukung gagasan manawa 5-iodoindole, kaya avermectin, kaiket rapet karo situs aktif reseptor. 5-Iodoindole uga nyebabake macem-macem deformasi fenotipik ing nematoda, kalebu kolaps/penyusutan organ sing ora normal lan tambah vakuolisasi. Asil kasebut nuduhake manawa vakuola bisa uga nduweni peran ing pati sing dimediasi metilasi nematoda. Sing penting, 5-iodoindole ora beracun kanggo spesies tanduran (kubis lan lobak). Dadi, panliten iki nduduhake yen aplikasi iodoindole ing kahanan lingkungan bisa ngontrol kerusakan layu pinus.
Nematoda kayu pinus (Bursaphelenchus xylophilus) kalebu nematoda kayu pinus (PWN), nematoda endoparasit migrasi sing dikenal nyebabake kerusakan ekologis sing parah ing ekosistem alas pinus1. Penyakit layu pinus (PWD) sing disebabake dening nematoda kayu pinus dadi masalah serius ing sawetara bawana, kalebu Asia lan Eropa, lan ing Amerika Utara, nematoda ngrusak spesies pinus sing dikenalake1,2. Penurunan wit pinus minangka masalah ekonomi utama, lan prospek panyebaran global nguwatirake3. Spesies pinus ing ngisor iki sing paling umum diserang dening nematoda: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, lan Pinus radiata4. Nematoda pinus minangka penyakit serius sing bisa mateni wit pinus sajrone sawetara minggu utawa wulan sawise infeksi. Kajaba iku, wabah nematoda pinus umum ing macem-macem ekosistem, mula rantai infeksi sing terus-terusan wis ditetepake1.
Bursaphelenchus xylophilus iku nematoda parasit tanduran karantina sing kalebu superfamili Aphelenchoidea lan klad 102.5. Nematoda iki mangan jamur lan reproduksi ing jaringan kayu wit pinus, berkembang dadi patang tahapan larva sing beda: L1, L2, L3, L4 lan individu diwasa1,6. Ing kahanan kekurangan pangan, nematoda pinus mlebu ing tahapan larva khusus - dauer, sing dadi parasit vektor - kumbang kulit kayu pinus (Monochamus alternatus) lan ditransfer menyang wit pinus sing sehat. Ing inang sing sehat, nematoda cepet migrasi liwat jaringan tanduran lan mangan sel parenkim, sing nyebabake sawetara reaksi hipersensitivitas, layu pinus lan pati sajrone setaun sawise infeksi1,7,8.
Pengendalian biologis nematoda pinus wis suwe dadi tantangan, kanthi langkah-langkah karantina wiwit abad kaping 20. Strategi saiki kanggo ngontrol nematoda pinus utamane nglibatake perawatan kimia, kalebu fumigasi kayu lan implantasi nematisida menyang batang wit. Nematisida sing paling umum digunakake yaiku avermectin lan avermectin benzoat, sing kalebu kulawarga avermectin. Bahan kimia sing larang iki efektif banget nglawan akeh spesies nematoda lan dianggep aman kanggo lingkungan9. Nanging, panggunaan nematisida iki sing bola-bali diarepake bakal nggawe tekanan seleksi sing meh mesthi bakal nyebabake munculé nematoda pinus sing tahan, kaya sing wis dituduhake kanggo sawetara hama serangga, kayata Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella lan nematoda Trichostrongylus colubriformis lan Ostertagia circumcincta, sing mboko sithik ngembangake resistensi marang avermectin10,11,12. Mulane, pola resistensi kudu disinaoni kanthi rutin lan nematisida disaring terus-terusan kanggo nemokake langkah-langkah alternatif, efektif biaya lan ramah lingkungan kanggo ngontrol PVD. Ing dasawarsa pungkasan, sawetara penulis wis ngusulake panggunaan ekstrak tanduran, lenga atsiri, lan bahan volatil minangka agen kontrol nematoda13,14,15,16.
Kita bubar nduduhake aktivitas nematisida indol, molekul sinyal antar sel lan antar kerajaan, ing Caenorhabditis elegans 17. Indole minangka sinyal intraseluler sing nyebar ing ekologi mikroba, ngontrol pirang-pirang fungsi sing mengaruhi fisiologi mikroba, pembentukan spora, stabilitas plasmid, resistensi obat, pembentukan biofilm, lan virulensi 18, 19. Aktivitas indol lan turunane nglawan nematoda patogen liyane durung ditliti. Ing panliten iki, kita nyelidiki aktivitas nematisida 34 indol nglawan nematoda pinus lan njlentrehake mekanisme aksi 5-iodoindole sing paling kuat nggunakake mikroskop, fotografi selang wektu, lan eksperimen docking molekuler, lan netepake efek beracun ing tanduran nggunakake uji perkecambahan wiji.
Konsentrasi indol sing dhuwur (>1,0 mM) wis dilapurake sadurunge duwe efek nematisida marang nematoda17. Sawise perawatan B. xylophilus (tahap urip campuran) nganggo indol utawa 33 turunan indol sing beda ing 1 mM, mortalitas B. xylophilus diukur kanthi ngetung nematoda urip lan mati ing klompok kontrol lan sing diobati. Lima indol nuduhake aktivitas nematisida sing signifikan; kaslametané klompok kontrol sing ora diobati yaiku 95 ± 7% sawise 24 jam. Saka 34 indol sing dites, 5-iodoindole lan 4-fluoroindole ing 1 mM nyebabake mortalitas 100%, dene 5,6-difluoroindigo, metilindole-7-karboksilat, lan 7-iodoindole nyebabake mortalitas kira-kira 50% (Tabel 1).
Efek 5-iodoindole marang pembentukan vakuola lan metabolisme nematoda kayu pinus. (A) Efek avermectin lan 5-iodoindole marang nematoda lanang diwasa, (B) endhog nematoda tahap L1 lan (C) metabolisme B. xylophilus, (i) vakuola ora diamati ing jam 0, perawatan nyebabake (ii) vakuola, (iii) akumulasi pirang-pirang vakuola, (iv) pembengkakan vakuola, (v) fusi vakuola lan (vi) pembentukan vakuola raksasa. Panah abang nuduhake pembengkakan vakuola, panah biru nuduhake fusi vakuola lan panah ireng nuduhake vakuola raksasa. Batang skala = 50 μm.
Kajaba iku, panliten iki uga njlentrehake proses sekuensial pati sing disebabake metana ing nematoda pinus (Gambar 4C). Pati metanogenik minangka jinis pati sel non-apoptosis sing ana gandhengane karo akumulasi vakuola sitoplasma sing menonjol27. Cacat morfologis sing diamati ing nematoda pinus katon ana hubungane karo mekanisme pati sing disebabake metana. Pamriksaan mikroskopis ing wektu sing beda-beda nuduhake yen vakuola raksasa kawangun sawise 20 jam paparan 5-iodoindole (0,1 mM). Vakuola mikroskopis diamati sawise 8 jam perawatan, lan jumlahe tambah sawise 12 jam. Sawetara vakuola gedhe diamati sawise 14 jam. Sawetara vakuola sing nyawiji katon jelas sawise 12-16 jam perawatan, nuduhake yen fusi vakuola minangka basis mekanisme pati metanogenik. Sawise 20 jam, sawetara vakuola raksasa ditemokake ing saindenging cacing. Pengamatan kasebut minangka laporan pertama metuosis ing C. elegans.
Ing cacing sing diobati 5-iodoindole, agregasi lan pecah vakuola uga diamati (Gambar 5), kaya sing dibuktekake dening mlengkunge cacing lan pelepasan vakuola menyang lingkungan. Gangguan vakuola uga diamati ing membran cangkang endhog, sing biasane dijaga utuh dening L2 sajrone netes (Gambar Tambahan S2). Pengamatan kasebut ndhukung keterlibatan akumulasi cairan lan kegagalan osmoregulasi, uga cedera sel sing bisa dibalikke (RCI), ing proses pembentukan vakuola lan supurasi (Gambar 5).
Kanthi hipotesis peran yodium ing pembentukan vakuola sing diamati, kita nyelidiki aktivitas nematisida natrium iodida (NaI) lan kalium iodida (KI). Nanging, ing konsentrasi (0,1, 0,5 utawa 1 mM), ora mengaruhi kelangsungan urip nematoda utawa pembentukan vakuola (Gambar Tambahan S5), sanajan 1 mM KI duwe efek nematisida sing sithik. Ing sisih liya, 7-iodoindole (1 utawa 2 mM), kaya 5-iodoindole, nyebabake pirang-pirang vakuola lan deformasi struktural (Gambar Tambahan S6). Loro iodoindole nuduhake karakteristik fenotipik sing padha ing nematoda pinus, dene NaI lan KI ora. Menariknya, indol ora nyebabake pembentukan vakuola ing B. xylophilus ing konsentrasi sing dites (data ora ditampilake). Dadi, asil kasebut ngonfirmasi manawa kompleks indole-iodin tanggung jawab kanggo vakuolisasi lan metabolisme B. xylophilus.
Ing antarane indol sing diuji kanggo aktivitas nematisida, 5-iodoindole nduweni indeks slip paling dhuwur yaiku -5,89 kkal/mol, diikuti dening 7-iodoindole (-4,48 kkal/mol), 4-fluoroindole (-4,33), lan indol (-4,03) (Gambar 6). Ikatan hidrogen tulang punggung sing kuwat saka 5-iodoindole karo leusin 218 nyetabilake ikatane, dene kabeh turunan indol liyane kaiket karo serin 260 liwat ikatan hidrogen rantai samping. Ing antarane iodoindole model liyane, 2-iodoindole nduweni nilai ikatan -5,248 kkal/mol, sing amarga ikatan hidrogen utama karo leusin 218. Ikatan liyane sing dikenal kalebu 3-iodoindole (-4,3 kkal/mol), 4-iodoindole (-4,0 kkal/mol), lan 6-fluoroindole (-2,6 kkal/mol) (Gambar Tambahan S8). Sebagéan gedhé indol halogenasi lan indol dhéwé, kajaba 5-iodoindole lan 2-iodoindole, mbentuk ikatan karo serin 260. Kasunyatan manawa ikatan hidrogen karo leusin 218 nuduhake ikatan reseptor-ligan sing efisien, kaya sing diamati kanggo ivermectin (Gambar Tambahan S7), ngonfirmasi manawa 5-iodoindole lan 2-iodoindole, kaya ivermectin, kaiket rapet karo situs aktif reseptor GluCL liwat leusin 218 (Gambar 6 lan Gambar Tambahan S8). Kita ngusulake manawa ikatan iki dibutuhake kanggo njaga struktur pori mbukak saka kompleks GluCL lan kanthi ikatan rapet karo situs aktif reseptor GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin lan ivermectin kanthi mangkono njaga saluran ion mbukak lan ngidini panyerepan cairan.
Docking molekuler indol lan indol terhalogenasi menyang GluCL. Orientasi ikatan ligan (A) indol, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole, lan (D) 5-iodoindole menyang situs aktif GluCL. Protein kasebut diwakili dening pita, lan ikatan hidrogen tulang punggung dituduhake minangka garis putus-putus kuning. (A′), (B′), (C′), lan (D′) nuduhake interaksi ligan sing cocog karo residu asam amino ing sekitar, lan ikatan hidrogen rantai samping dituduhake dening panah putus-putus jambon.
Eksperimen ditindakake kanggo ngevaluasi efek beracun 5-iodoindole marang perkecambahan wiji kubis lan lobak. 5-iodoindole (0,05 utawa 0,1 mM) utawa avermectin (10 μg/mL) nduweni efek sithik utawa ora ana pengaruh marang perkecambahan awal lan munculé plantlet (Gambar 7). Kajaba iku, ora ana bedane sing signifikan antarane tingkat perkecambahan kontrol sing ora diobati lan wiji sing diobati nganggo 5-iodoindole utawa avermectin. Efek marang pemanjangan oyot tunggang lan jumlah oyot lateral sing kawangun ora signifikan, sanajan 1 mM (10 kali konsentrasi aktif) saka 5-iodoindole rada nundha perkembangan oyot lateral. Asil kasebut nuduhake yen 5-iodoindole ora beracun kanggo sel tanduran lan ora ngganggu proses perkembangan tanduran ing konsentrasi sing ditliti.
Efek 5-iodoindole marang perkecambahan wiji. Perkecambahan, tunas, lan perakaran lateral wiji B. oleracea lan R. raphanistrum ing medium agar Murashige lan Skoog nganggo utawa tanpa avermectin utawa 5-iodoindole. Perkecambahan dicathet sawise 3 dina inkubasi ing suhu 22°C.
Panliten iki nglaporake sawetara kasus pembunuhan nematoda dening indol. Sing penting, iki minangka laporan pertama babagan metilasi sing nyebabake iodoindole (proses sing disebabake dening akumulasi vakuola cilik sing mboko sithik nyawiji dadi vakuola raksasa, sing pungkasane nyebabake pecah membran lan pati) ing jarum pinus, kanthi iodoindole nuduhake sifat nematisida sing signifikan sing padha karo nematisida komersial avermectin.
Indole wis dilapurake sadurunge duwe pirang-pirang fungsi sinyal ing prokariota lan eukariota, kalebu inhibisi/pembentukan biofilm, kaslametan bakteri, lan patogenisitas19,32,33,34. Bubar iki, efek terapeutik potensial saka indol terhalogenasi, alkaloid indol, lan turunan indol semisintetik wis narik kawigaten riset sing ekstensif35,36,37. Contone, indol terhalogenasi wis dituduhake bisa mateni sel Escherichia coli lan Staphylococcus aureus sing terus-terusan37. Kajaba iku, penting kanggo nyinaoni efektifitas indol terhalogenasi marang spesies, genera, lan kerajaan liyane, lan panliten iki minangka langkah kanggo nggayuh tujuan iki.
Ing kene, kita ngusulake mekanisme kanggo lethality sing diinduksi 5-iodoindole ing C. elegans adhedhasar cedera sel sing bisa dibalikke (RCI) lan metilasi (Gambar 4C lan 5). Owah-owahan edema kayata bengkak lan degenerasi vakuolar minangka indikator RCI lan metilasi, sing diwujudake minangka vakuola raksasa ing sitoplasma48,49. RCI ngganggu produksi energi kanthi nyuda produksi ATP, nyebabake kegagalan pompa ATPase, utawa ngganggu membran sel lan nyebabake masuknya Na+, Ca2+, lan banyu kanthi cepet50,51,52. Vakuola intrasitoplasma muncul ing sel kewan minangka akibat saka akumulasi cairan ing sitoplasma amarga masuknya Ca2+ lan banyu53. Menariknya, mekanisme kerusakan sel iki bisa dibalikke yen kerusakan kasebut sementara lan sel wiwit ngasilake ATP sajrone wektu tartamtu, nanging yen kerusakan terus utawa saya parah, sel kasebut mati.54 Pengamatan kita nuduhake yen nematoda sing diobati nganggo 5-iodoindole ora bisa mulihake biosintesis normal sawise kena pengaruh kahanan stres.
Fenotipe metilasi sing diinduksi dening 5-iodoindole ing B. xylophilus bisa uga amarga anane yodium lan distribusi molekuler, amarga 7-iodoindole duwe efek inhibisi sing luwih sithik ing B. xylophilus tinimbang 5-iodoindole (Tabel 1 lan Gambar Tambahan S6). Asil kasebut sebagian konsisten karo panliten Maltese et al. (2014), sing nglaporake manawa translokasi gugus nitrogen piridil ing indol saka posisi para- menyang meta-ngilangi vakuolisasi, inhibisi pertumbuhan, lan sitotoksisitas ing sel U251, sing nuduhake manawa interaksi molekul karo situs aktif tartamtu ing protein iku penting banget. Interaksi antarane indol utawa indol terhalogenasi lan reseptor GluCL sing diamati ing panliten iki uga ndhukung gagasan iki, amarga 5- lan 2-iodoindole ditemokake kaiket karo reseptor GluCL luwih kuwat tinimbang indol liyane sing ditliti (Gambar 6 lan Gambar Tambahan S8). Yodium ing posisi kapindho utawa kaping lima indol ditemokake kaiket karo leusin 218 saka reseptor GluCL liwat ikatan hidrogen tulang punggung, dene indol terhalogenasi liyane lan indol dhewe mbentuk ikatan hidrogen rantai samping sing lemah karo serin 260 (Gambar 6). Mulane, kita berspekulasi yen lokalisasi halogen nduweni peran penting ing induksi degenerasi vakuolar, dene ikatan 5-iodoindole sing rapet njaga saluran ion tetep mbukak, saengga ngidini cairan mlebu kanthi cepet lan pecah vakuola. Nanging, mekanisme aksi 5-iodoindole sing rinci isih kudu ditemtokake.
Sadurunge aplikasi praktis 5-iodoindole, efek beracun ing tanduran kudu dianalisis. Eksperimen perkecambahan wiji nuduhake yen 5-iodoindole ora duwe efek negatif ing perkecambahan wiji utawa proses perkembangan sabanjure ing konsentrasi sing ditliti (Gambar 7). Dadi, panliten iki nyedhiyakake dhasar kanggo panggunaan 5-iodoindole ing lingkungan ekologis kanggo ngontrol bahaya nematoda pinus marang wit pinus.
Laporan sadurunge wis nuduhake yen terapi berbasis indol minangka pendekatan potensial kanggo ngatasi masalah resistensi antibiotik lan perkembangan kanker55. Kajaba iku, indol nduweni aktivitas antibakteri, antikanker, antioksidan, anti-inflamasi, antidiabetes, antivirus, antiproliferatif lan antituberkulosis lan bisa dadi basis sing janjeni kanggo pangembangan obat56,57. Panliten iki kanggo pisanan nyaranake potensial panggunaan yodium minangka agen antiparasit lan anthelmintik.
Avermectin ditemokake telung dekade kepungkur lan menang Hadiah Nobel ing taun 2015, lan panggunaane minangka anthelmintik isih aktif. Nanging, amarga perkembangan resistensi sing cepet marang avermectin ing nematoda lan hama serangga, strategi alternatif, murah, lan ramah lingkungan dibutuhake kanggo ngontrol infeksi PWN ing wit pinus. Panliten iki uga nglaporake mekanisme 5-iodoindole mateni nematoda pinus lan 5-iodoindole duwe keracunan sing sithik kanggo sel tanduran, sing mbukak prospek sing apik kanggo aplikasi komersial ing mangsa ngarep.
Kabeh eksperimen wis disetujoni dening Komite Etika Universitas Yeungnam, Gyeongsan, Korea, lan metode kasebut ditindakake miturut pedoman Komite Etika Universitas Yeungnam.
Eksperimen inkubasi endhog ditindakake nggunakake prosedur sing wis ditetepake43. Kanggo netepake tingkat penetasan (HR), nematoda diwasa umur 1 dina (kurang luwih 100 wadon lan 100 lanang) dipindhah menyang cawan Petri sing ngemot jamur lan diidini tuwuh sajrone 24 jam. Endhog banjur diisolasi lan diobati nganggo 5-iodoindole (0,05 mM lan 0,1 mM) utawa avermectin (10 μg/ml) minangka suspensi ing banyu suling steril. Suspensi kasebut (500 μl; kurang luwih 100 endhog) dipindhah menyang sumur piring kultur jaringan 24 sumur lan diinkubasi ing suhu 22 °C. Cacah L2 digawe sawise 24 jam inkubasi nanging dianggep mati yen sel ora obah nalika distimulasi nganggo kawat platinum sing apik. Eksperimen iki ditindakake ing rong tahap, saben tahap kanthi enem pengulangan. Data saka loro eksperimen kasebut digabungake lan ditampilake. Persentase HR diitung kaya ing ngisor iki:
Mortalitas larva ditaksir nggunakake prosedur sing wis dikembangake sadurunge. Endhog nematoda dikumpulake lan embrio disinkronake kanthi netes ing banyu suling steril kanggo ngasilake larva tahap L2. Larva sing disinkronake (kurang luwih 500 nematoda) diobati nganggo 5-iodoindole (0,05 mM lan 0,1 mM) utawa avermectin (10 μg/ml) lan dikembangke ing piring Petri B. cinerea. Sawise inkubasi 48 jam ing suhu 22 °C, nematoda dikumpulake ing banyu suling steril lan ditliti kanggo anane tahap L2, L3, lan L4. Anane tahap L3 lan L4 nuduhake transformasi larva, dene anane tahap L2 nuduhake ora ana transformasi. Gambar dijupuk nggunakake Sistem Pencitraan Sel Digital iRiS™. Eksperimen iki ditindakake ing rong tahap, saben tahap kanthi enem pengulangan. Data saka loro eksperimen kasebut digabungake lan ditampilake.
Toksisitas 5-iodoindole lan avermectin marang wiji ditaksir nggunakake tes perkecambahan ing piring agar Murashige lan Skoog.62 Wiji B. oleracea lan R. raphanistrum direndhem dhisik ing banyu suling steril sajrone sedina, dikumbah nganggo 1 ml etanol 100%, disterilisasi nganggo 1 ml pemutih komersial 50% (3% natrium hipoklorit) sajrone 15 menit, lan dikumbah kaping lima nganggo 1 ml banyu steril. Wiji sing wis disterilisasi banjur dipencet ing piring agar perkecambahan sing ngemot 0,86 g/l (0,2X) medium Murashige lan Skoog lan 0,7% agar bakteriologis nganggo utawa tanpa 5-iodoindole utawa avermectin. Piring kasebut banjur diinkubasi ing suhu 22 °C, lan gambar dijupuk sawise 3 dina inkubasi. Eksperimen iki ditindakake ing rong tahap, saben tahap duwe enem pengulangan.
Wektu kiriman: 26 Februari 2025