Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates.Kanggo asil sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake versi browser sing luwih anyar (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Ing sawetoro wektu, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita nuduhake situs kasebut tanpa gaya utawa JavaScript.
Panemuan lan panggunaan produk alami sing migunani bisa mbantu ningkatake urip manungsa.Bahan kimia penghambat pertumbuhan tanduran digunakake minangka herbisida kanggo ngontrol gulma.Amarga perlu kanggo nggunakake macem-macem jinis herbisida, ana perlu kanggo ngenali senyawa karo mekanisme anyar saka tumindak.Ing panliten iki, kita nemokake senyawa N -alkoxypyrrole novel, coumamonamide, saka Streptomyces werraensis MK493-CF1 lan nggawe proses sintesis lengkap.Liwat tes aktivitas biologis, kita nemokake yen asam urs-monoamic minangka perantara sintetik saka urs-monoamide lan potensial.inhibitor wutah tanduran.Kajaba iku, kita wis ngembangake macem-macem turunan asam urbenonik, kalebu turunan urbenyloxy (UDA), sing nduweni aktivitas herbisida sing dhuwur tanpa mengaruhi pertumbuhan sel HeLa.Kita uga nemokake yen turunan asam urmotonat ngganggu mikrotubulus tanduran;Kajaba iku, KAND mengaruhi filamen aktin lan nyebabake pati sel;Efek multifaset iki beda karo inhibitor mikrotubulus sing dikenal lan nyaranake mekanisme aksi anyar kanggo asam ursonik, sing nuduhake kauntungan penting ing pangembangan herbisida anyar.
Penemuan lan aplikasi praktis saka produk alam sing migunani lan turunane minangka sarana kanggo ningkatake kualitas urip manungsa.Metabolit sekunder sing diasilake dening mikroorganisme, tanduran lan serangga wis nyebabake kemajuan gedhe ing babagan obat lan tetanen.Akeh antibiotik lan obat anti-leukemia wis dikembangake saka produk alami.Kajaba iku, macem-macem jinispestisida, fungisida lan herbisida diekstrak saka produk alami iki kanggo digunakake ing tetanèn.Utamane, herbisida kontrol gulma minangka alat penting kanggo nambah panenan panen ing tetanèn modern, lan macem-macem jinis senyawa wis digunakake sacara komersial.Sawetara proses seluler ing tetanduran, kayata fotosintesis, metabolisme asam amino, sintesis tembok sel, regulasi mitosis, sinyal phytohormone, utawa sintesis protein, dianggep minangka target khas herbisida.Senyawa sing nyandhet fungsi microtubule minangka kelas herbisida umum sing mengaruhi wutah tanduran kanthi mengaruhi regulasi mitosis2.
Mikrotubulus minangka komponen sitoskeleton lan akeh disimpen ing sel eukariotik.Heterodimer tubulin kasusun saka α-tubulin lan β-tubulin sing mbentuk protofilamen mikrotubulus linier, kanthi 13 protofilamen sing mbentuk struktur silinder.Mikrotubulus nduweni peran akeh ing sel tanduran, kalebu nemtokake wangun sel, divisi sel, lan transportasi intraseluler3,4.Sel tanduran ngemot mikrotubulus ing sangisore membran plasma interphase, lan mikrotubulus kortikal sing disebut iki dianggep ngontrol organisasi mikrofibril selulosa liwat regulasi kompleks selulosa sintase4,5.Mikrotubulus kortikal saka sel epidermis oyod, sing ana ing zona elongasi kanthi cepet saka ujung akar, dumunung ing lateral, lan microfibers selulosa ngetutake mikrotubulus kasebut lan mbatesi arah ekspansi sel, saéngga ningkatake elongasi sel anisotropik.Mula, fungsi mikrotubulus raket banget karo morfologi tetuwuhan.Substitusi asam amino ing gen enkoding tubulin nyebabake miring susunan microtubule kortikal lan wutah sisih kiwa utawa tengen ing Arabidopsis 6,7.Kajaba iku, mutasi ing protein sing ana gandhengane karo mikrotubulus sing ngatur dinamika mikrotubulus uga bisa nyebabake wutah oyod sing kleru8,9,10,11,12,13.Kajaba iku, perawatan karo herbisida microtubule-disrupting kayata disopyramide, uga dikenal minangka pretilachlor, uga nimbulaké wutah oblique oblique sisih kiwa14.Data kasebut nuduhake manawa pangaturan fungsi mikrotubulus sing tepat penting kanggo nemtokake arah pertumbuhan tanduran.
Macem-macem jinis inhibitor microtubule wis ditemokake, lan obat-obatan kasebut duwe kontribusi sing signifikan kanggo riset sitoskeletal, uga kanggo tetanèn lan obat2.Utamane, oryzalin, senyawa dinitroaniline, disopyramide, senyawa sing gegandhengan karo benzamide, lan analoge bisa nyandhet fungsi mikrotubulus lan kanthi mangkono nyandhet wutah tanduran.Mulane, akeh digunakake minangka herbisida.Nanging, amarga mikrotubulus minangka komponen penting saka sel tanduran lan kewan, akeh inhibitor mikrotubulus sitotoksik kanggo loro jinis sel kasebut.Mulane, senadyan utilitas sing diakoni minangka herbisida, sawetara agen antimikrotubulus sing winates digunakake kanggo tujuan praktis.
Streptomyces minangka genus saka kulawarga Streptomyces, sing kalebu bakteri aerobik, gram-positif, filamentous lan misuwur amarga kemampuane ngasilake macem-macem metabolit sekunder.Mulane, iki dianggep minangka salah sawijining sumber sing paling penting kanggo produk alami sing aktif sacara biologis.Ing panliten saiki, kita nemokake senyawa anyar sing diarani coumamonamide, sing diisolasi saka Streptomyces werraensis MK493-CF1 lan S. werraensis ISP 5486. Nggunakake analisis spektral lan analisis spektral lengkap, struktur coumamonamide ditondoi lan kerangka N-alkoxypyrrole sing unik. ditemtokake.sintesis.Asam Ursmonic, perantara sintetik saka ursmonoamide lan turunane, ditemokake kanggo nyegah wutah lan germination saka tanduran model populer Arabidopsis thaliana.Ing studi hubungan struktur-aktivitas, kita nemokake manawa senyawa karo C9 sing diowahi dadi asam ursonat, sing diarani turunan asam ursonat nonyloxy (KAND), kanthi nyata nambah efek nyegah ing wutah lan germination.Utamane, inhibitor wutah tanduran sing mentas ditemokake uga kena pengaruh wutah tembakau lan liverwort lan ora sitotoksik kanggo bakteri utawa sel HeLa.Kajaba iku, sawetara turunan asam urmotonat nyebabake fenotipe akar sing kleru, sing nuduhake yen turunan kasebut langsung utawa ora langsung mengaruhi mikrotubulus.Selaras karo gagasan iki, pengamatan kita babagan mikrotubulus kanthi label imunohistokimia utawa protein fluoresensi nuduhake yen perawatan KAND ngrusak mikrotubulus.Kajaba iku, perawatan karo turunan asam kumamotonat ngganggu mikrofilamen aktin.Mangkono, kita wis nemokake inhibitor wutah tanduran anyar sing mekanisme unik tumindak melu karusakan saka sitoskeleton.
Strain MK493-CF1 diisolasi saka lemah ing Shinagawa-ku, Tokyo.Galur MK493-CF1 mbentuk miselium stroma kanthi cabang apik.Urutan parsial saka gen RNA ribosom 16S (1422 bp) ditemtokake.Galur iki meh padha karo S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: galur khas, 99,93%).Adhedhasar asil kasebut, ditemtokake manawa galur iki raket banget karo jinis galur S. werraensis.Mulane, kita sementara dijenengi galur iki S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T uga ngasilake senyawa bioaktif sing padha.Amarga ora ana riset awal kanggo njupuk produk alami saka mikroorganisme iki, riset kimia luwih ditindakake.Sawise budidaya S. werraensis MK493-CF1 ing medium barley kanthi fermentasi solid-state ing 30 ° C suwene 14 dina, medium kasebut diekstraksi nganggo 50% EtOH.60 ml sampel dikeringkan untuk memperoleh 59,5 mg ekstrak kasar.Ekstrak mentah kasebut kena HPLC fase mbalikke kanggo menehi N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, jenenge coumamonamide, 36,0 mg).Jumlah total 1 kira-kira 60% saka ekstrak mentah.Mula, kita mutusake sinau kanthi rinci babagan sifat kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 minangka bubuk amorf putih lan spektrometri massa resolusi dhuwur (HRESIMS) nandheske C6H8N2O2 (Gambar 1).Fragmen pirol sing diganti C2 saka senyawa iki ditondoi dening δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH ing spektrum 1H NMR: 4,5 Hz , H-5) lan δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), lan spektrum 13C NMR nuduhake anané papat atom karbon sp2.Anane gugus amida ing posisi C2 ditaksir kanthi korélasi HMBC saka proton C-3 menyang karbon amida karbonil ing δC 161.1.Kajaba iku, 1 H lan 13 C NMR puncak ing δH 4.10 (3H, S) lan δC 68.3 nuduhake anané gugus N-metoxy ing molekul.Sanajan posisi gugus methoxy sing bener durung ditemtokake nggunakake analisis spektroskopi kayata spektroskopi beda sing ditingkatake lan singkatan Overhauser nuklir (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide dadi senyawa calon pisanan.
Kanggo nemtokake struktur sing bener saka 1, sintesis total ditindakake (Gambar 2a).Pangobatan 2-aminopyridine 2 sing kasedhiya kanthi komersial kanthi m-CPBA ngasilake N-oksida 3 sing cocog ing asil kuantitatif.Sawise 2-aminoazidation saka 2, reaksi siklokondensasi sing diterangake dening Abramovich ditindakake ing benzena ing 90 ° C kanggo entuk 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile sing dikarepake 5 ing gram.Kacepetan 60% (rong tahap).15,16.Metilasi lan hidrolisis 4 banjur menehi 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (disebut "asam cumotonic", 6) kanthi asil apik (70%, rong langkah).Pungkasan, amidasi liwat asam klorida intermediate 6 nggunakake amonia banyu menehi Kumamoto amida 1 ing 98% ngasilaken.Kabeh data spektral sing disintesis 1 padha karo terisolasi 1, saengga struktur 1 ditemtokake;
Sintesis umum lan analisis aktivitas biologis urbenamide lan asam urbenic.(a) Total sintesis amida Kumamoto.(b) Bibit Arabidopsis Columbia (Col) jinis liar umur pitung dina ditanam ing piring Murashige lan Skoog (MS) sing ngemot coumamonamide 6 utawa coumamonamide 1 ing konsentrasi sing dituduhake.Skala bar = 1 cm.
Kaping pisanan, kita ngevaluasi aktivitas biologis urbenamide lan intermediet kanggo kemampuan kanggo modulasi wutah tanduran.Kita nambahake macem-macem konsentrasi ursmonamide 1 utawa asam ursmonic 6 menyang medium MS agar lan bibit Arabidopsis thaliana sing dibudidaya ing medium iki.Assays iki nuduhake yen konsentrasi dhuwur (500 μM) saka 6 nyandhet wutah ROOT (Fig. 2b).Sabanjure, kita ngasilake macem-macem turunan kanthi ngganti posisi N1 saka 6 lan nindakake studi hubungan struktur-aktivitas (proses sintesis analog diterangake ing Informasi Dhukungan (SI)).Bibit Arabidopsis ditanam ing medium sing ngemot 50 μM turunan asam ursonic, lan dawa oyod diukur.kaya sing dituduhake ing gambar.Kaya sing dituduhake ing Gambar 3a, b, lan S1, asam coumamo duwe dawa rantai alkoksi linier sing beda (9, 10, 11, 12, lan 13) utawa rantai alkoksi gedhe (15, 16, lan 17) ing posisi N1.Turunan kasebut nuduhake inhibisi pertumbuhan oyod sing signifikan.Kajaba iku, kita nemokake yen aplikasi 200 μM 10, 11, utawa 17 nyegah germination (Gambar 3c lan S2).
Sinau hubungan struktur-aktivitas amida Kumamoto lan senyawa sing gegandhengan.(a) Struktur lan skema sintesis analog.(b) Kuantifikasi dawa oyod saka tunas umur 7 dina sing ditanam ing medium MS kanthi utawa tanpa turunan coumamonamide 50 μM.Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan karo perawatan palsu (t test, p<0,05).n>18. Data dipungambaraken rata-rata ± SD.nt tegese "ora dites" amarga luwih saka 50% saka wiji ora germinated.(c) Kuantifikasi tingkat germinasi wiji sing diolah sing diinkubasi suwene 7 dina ing medium MS kanthi utawa tanpa 200 μM coumamonamide lan senyawa sing ana gandhengane.Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan karo perawatan palsu (tes chi-kuadrat).n=96.
Sing nggumunake, tambahan rantai sisih alkil sing luwih dawa tinimbang C9 nyuda aktivitas inhibisi, nuduhake manawa senyawa sing ana gandhengane karo asam kumamotoat mbutuhake ranté sisih kanthi ukuran tartamtu kanggo nuduhake aktivitas biologis.
Amarga analisis hubungan struktur-aktivitas nuduhake yen C9 diowahi dadi asam ursonat lan turunan nonyloxy saka asam ursonat (sabanjuré diarani KAND 11) minangka inhibitor pertumbuhan tanduran sing paling efektif, kita nganakake karakterisasi KAND 11 sing luwih rinci. Perawatan Arabidopsis kanthi 50 μM KAND 11 meh nyegah germination, dene konsentrasi sing luwih murah (40, 30, 20, utawa 10 μM) saka KAND 11 nyandhet wutah oyod kanthi cara gumantung dosis (Gambar 4a, b).Kanggo nguji apa KAND 11 mengaruhi kelangsungan meristem akar, kita mriksa meristem akar sing diwarnai propidium iodide (PI) lan ukuran area meristem sing diukur.Ukuran meristem tunas sing ditanam ing medium sing ngemot 25 μM KAND-11 yaiku 151,1 ± 32,5 μm, dene ukuran meristem tunas sing ditanam ing media kontrol sing ngemot DMSO yaiku 264,7 ± 30,8 μm (Gambar 4c, d). , sing nuduhake yen KAND-11 mulihake aktivitas seluler.nyebar.Meristem akar.Selaras karo iki, perawatan KAND 11 nyuda jumlah marker divisi sel CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS sinyal ing meristem ROOT (Fig. 4e) 17.Asil kasebut nuduhake yen KAND 11 nyegah pertumbuhan oyod kanthi nyuda aktivitas proliferasi sel.
Analisis efek hambat saka turunan asam urbenonik (turunan urbenyloxy) ing wutah.(a) Bibit Col jinis liar umur 7 dina sing ditanam ing piring MS kanthi konsentrasi KAND 11 sing dituduhake. Skala bar = 1 cm.(b) Jumlah dawa ROOT.Huruf nuduhake beda sing signifikan (test Tukey HSD, p<0,05).n>16. Data dipungambaraken rata-rata ± SD.(c) Mikroskopi confocal saka propidium iodide-diwarnai werna liar Col werna thukul ing piring MS karo utawa tanpa 25 μM KAND 11. Kurung putih nuduhake meristem ROOT.Skala bar = 100 µm.(d) Kuantifikasi ukuran meristem akar (n = 10 nganti 11).Bedane statistik ditemtokake nggunakake t-test (p<0,05).Bar kasebut nuduhake ukuran meristem rata-rata.(e) Mikroskopi kontras interferensi diferensial (DIC) saka meristem akar sing ngemot konstruk CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS diwarnai lan diwarnai ing tunas umur 5 dina sing ditanam ing piring MS kanthi utawa tanpa uji KAND 25 µM.
Toksisitas KAND 11 dites maneh nggunakake tanduran dicotyledonous liyane, tembakau (Nicotiana tabacum), lan organisme model tanduran darat utama, liverwort (Marchantia polymorpha).Kaya ing kasus Arabidopsis, tunas tembakau SR-1 sing ditanam ing medium sing ngemot 25 μM KAND 11 ngasilake oyod sing luwih cendhek (Gambar 5a).Kajaba iku, 40 saka 48 wiji germinated ing piring ngemot 200 μM KAND 11, dene kabeh 48 wiji germinated ing media diolok-olok, nuduhake yen konsentrasi dhuwur saka KAND iku signifikan (p<0.05;chi test -square) nyandhet germination saka rokok.(Gambar 5b).Kajaba iku, konsentrasi KAND 11 sing nyegah pertumbuhan bakteri ing liverwort padha karo konsentrasi efektif ing Arabidopsis (Gambar 5c).Asil kasebut nuduhake yen KAND 11 bisa ngalangi tuwuhe macem-macem tanduran.Kita banjur nyelidiki kemungkinan sitotoksisitas senyawa sing ana gandhengane karo monoamida bear ing organisme liya, yaiku sel HeLa manungsa lan galur Escherichia coli DH5α, minangka wakil saka sel kewan lan bakteri sing luwih dhuwur.Ing seri tes proliferasi sel, kita mirsani yen coumamonamide 1, asam coumamonamidic 6, lan KAND 11 ora mengaruhi pertumbuhan sel HeLa utawa E. coli ing konsentrasi 100 μM (Gambar 5d, e).
Inhibisi pertumbuhan KAND 11 ing organisme non-Arabidopsis.(a) Bibit tembakau tipe liar SR-1 umur rong minggu ditanam ing piring MS vertikal sing ngemot 25 μM KAND 11. (b) Bibit tembakau tipe liar SR-1 umur rong minggu ditanam ing posisi horisontal. Piring MS ngemot 200 μM KAND 11. (c) Tunas liverwort Tak-1 jinis liar umur rong minggu sing ditanam ing piring Gamborg B5 kanthi konsentrasi KAND 11 sing dituduhake. Panah abang nuduhake spora sing mandheg tuwuh sajrone inkubasi rong minggu. wektu.(d) Uji proliferasi sel sel HeLa.Jumlah sel sing sregep diukur ing interval wektu tetep nggunakake kit cacah sel 8 (Dojindo).Minangka kontrol, sel HeLa diobati karo 5 μg / ml actinomycin D (Act D), sing nyegah transkripsi polimerase RNA lan nyebabake pati sel.Analisis dileksanakake ing rangkap tiga.(e) uji proliferasi sel E. coli.wutah E. coli dianalisis kanthi ngukur OD600.Minangka kontrol, sel diobati karo 50 μg / ml ampicillin (Amp), sing nyegah sintesis tembok sel bakteri.Analisis dileksanakake ing rangkap tiga.
Kanggo nemtokake mekanisme aksi sitotoksisitas sing disebabake dening senyawa sing gegandhengan karo uramide, kita nganalisa maneh turunan asam urbenik kanthi efek nyegah moderat.kaya sing dituduhake ing gambar.Kaya sing dituduhake ing Gambar 2b, 6a, tunas sing ditanam ing piring agar sing ngemot konsentrasi dhuwur (200 μM) asam urmotonat 6 ngasilake oyod sing luwih cendhek lan mlengkung kiwa (θ = - 23.7 ± 6.1), dene tunas sing ditanam ing medium kontrol, tunas ngasilake oyod sing meh lurus (θ = – 3,8 ± 7,1).Wutah miring karakteristik iki dikenal amarga disfungsi mikrotubulus korteks14,18.Konsisten karo temuan iki, obat-obatan sing ora stabil microtubule disopyramide lan oryzalin nyebabake miring oyod sing padha ing kahanan pertumbuhan kita (Fig. 2b, 6a).Ing wektu sing padha, kita nguji turunan asam urmotonik lan milih sawetara sing, ing konsentrasi tartamtu, nyebabake wutah oblique oblique.Senyawa 8, 9, lan 15 ngowahi arah pertumbuhan oyod kanthi masing-masing 75 μM, 50 μM, lan 40 μM, sing nuduhake yen senyawa kasebut bisa ngrusak mikrotubulus kanthi efektif (Gambar 2b, 6a).Kita uga nguji turunan asam ursolat sing paling kuat, KAND 11, kanthi konsentrasi sing luwih murah (15 µM) lan nemokake yen aplikasi KAND 11 nyegah pertumbuhan oyod lan arah pertumbuhan oyod ora rata, sanajan cenderung miring ngiwa ( Gambar C3)..Amarga konsentrasi sing luwih dhuwur saka obatan microtubule-destabilizing kadhangkala nyandhet wutah tanduran tinimbang nimbulaké tilting ROOT, kita salajengipun kabiji kamungkinan sing KAND 11 mengaruhi microtubule dening mirsani microtubule cortical ing sel epidermis ROOT.Imunohistokimia nggunakake antibodi anti-β-tubulin ing sel epidermis saka werna seedling sing diobati karo 25 μM KAND 11 nuduhake ilang meh kabeh mikrotubulus kortikal ing sel epidermis ing zona elongasi (Gambar 6b).Asil kasebut nuduhake yen asam kumamotonat lan turunane tumindak langsung utawa ora langsung ing mikrotubulus kanggo ngganggu lan senyawa kasebut minangka inhibitor mikrotubulus novel.
Asam ursonat lan turunane ngowahi mikrotubulus kortikal ing Arabidopsis thaliana.(a) Sudut inklinasi akar diukur ing ngarsane macem-macem turunan asam urmotonat ing konsentrasi sing dituduhake.Efek saka rong senyawa sing dikenal kanggo nyandhet microtubule: disopyramide lan oryzalin uga dianalisis.Inset nuduhake standar sing digunakake kanggo ngukur amba wutah ROOT.Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan karo perawatan palsu (t test, p<0,05).n>19. Skala bar = 1 cm.(b) Mikrotubulus kortikal ing sel epidermis ing zona elongasi.Mikrotubulus ing werna Arabidopsis Col jinis liar sing ditanam ing piring MS kanthi utawa tanpa 25 μM KAND 11 digambarake kanthi pewarnaan imunohistokimia nggunakake antibodi primer β-tubulin lan antibodi sekunder konjugasi Alexa Fluor.Skala bar = 10 µm.(c) Struktur mitosis mikrotubulus ing meristem akar.Mikrotubulus divisualisasikan menggunakan pewarnaan imunohistokimia.Struktur mitosis, kalebu zona prophase, spindle, lan phragmoplasts, diitung saka gambar confocal.Panah nuduhake struktur mikrotubulus mitosis.Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan karo perawatan palsu (t test, p<0,05).n>9. Skala bar = 50 µm.
Senajan Ursa nduweni kemampuan kanggo ngganggu fungsi mikrotubulus, mekanisme tumindake dikira beda karo agen depolimerisasi mikrotubulus sing khas.Contone, konsentrasi agen depolymerizing microtubule sing luwih dhuwur kayata disopyramide lan oryzalin nyebabake ekspansi anisotropik sel epidermis, dene KAND 11 ora.Kajaba iku, co-application saka KAND 11 lan disopyramide ngasilaken digabungake disopyramide-mlebu respon wutah ROOT lan KAND 11-inhibisi wutah diamati (Fig. S4).Kita uga nganalisa respon mutan disopyramide hipersensitif 1-1 (phs1-1) kanggo KAND 11. phs1-1 nduweni mutasi titik tubulin kinase non-kanonik lan ngasilake werna sing luwih cendhek nalika diobati nganggo disopyramide9,20.phs1-1 tunas mutant thukul ing medium agar ngemot KAND 11 duwe werna luwih cendhek padha thukul ing disopyramid (anjir. S5).
Kajaba iku, kita mirsani struktur mikrotubulus mitosis, kayata zona prophase, spindles, lan phragmoplasts, ing meristem ROOT saka tunas diobati karo KAND 11. Konsisten karo pengamatan kanggo CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, penurunan sing signifikan ing jumlah microtubule mitosis diamati (Fig. 6c).
Kanggo menehi ciri sitotoksisitas KAND 11 ing resolusi subselular, kita ngobati sel suspensi BY-2 tembakau kanthi KAND 11 lan mirsani tanggapane.Kaping pisanan, kita nambahake KAND 11 menyang sel BY-2 sing nuduhake TagRFP-TUA6, sing menehi label mikrotubulus kanthi fluoresensi, kanggo netepake efek KAND 11 ing mikrotubulus kortikal.Kapadhetan mikrotubulus kortikal ditaksir nggunakake analisis gambar, sing ngitung persentase piksel sitoskeletal ing antarane piksel sitoplasma.Asil tes nuduhake yen sawise perawatan karo 50 μM utawa 100 μM KAND 11 kanggo 1 jam, Kapadhetan mudhun sacara signifikan dadi 0,94 ± 0,74% utawa 0,23 ± 0,28%, masing-masing, nalika kapadhetan sel sing diobati karo DMSO, yaiku 1,61 ± 0,34. % (Gambar 7a).Asil kasebut konsisten karo pengamatan ing Arabidopsis yen perawatan KAND 11 nyebabake depolimerisasi mikrotubulus kortikal (Gambar 6b).Kita uga nliti garis BY-2 karo filamen aktin label GFP-ABD sawise perawatan kanthi konsentrasi KAND 11 sing padha lan diamati manawa perawatan KAND 11 ngganggu filamen aktin.Pangobatan kanthi 50 μM utawa 100 μM KAND 11 sajrone 1 jam kanthi signifikan nyuda kapadhetan filamen aktin dadi 1,20 ± 0,62% utawa 0,61 ± 0,26%, dene kapadhetan ing sel sing diobati DMSO yaiku 1,69 ± 0,51% (Fig.7b).Asil kasebut kontras karo efek propyzamide, sing ora mengaruhi filamen aktin, lan latrunculin B, depolymerizer aktin sing ora mengaruhi mikrotubulus (SI Figure S6).Kajaba iku, perawatan karo coumamonamide 1, asam coumamonamide 6, utawa KAND 11 ora mengaruhi mikrotubulus ing sel HeLa (SI Figure S7).Mangkono, mekanisme tumindak KAND 11 diyakini beda karo gangguan sitoskeleton sing dikenal.Kajaba iku, pengamatan mikroskopis saka sel BY-2 sing diobati karo KAND 11 nuduhake wiwitan pati sel sajrone perawatan KAND 11 lan nuduhake manawa proporsi sel mati sing diwarnai biru Evans ora mundhak sacara signifikan sawise 30 menit perawatan KAND 11, dene. sawise 90 menit perawatan karo 50 μM utawa 100 μM KAND, jumlah sel mati tambah dadi 43,7% utawa 80,1% (Gambar 7c).Digabungake, data kasebut nuduhake yen turunan asam ursolat KAND 11 minangka inhibitor sitoskeletal spesifik tanduran kanthi mekanisme tumindak sing durung dingerteni sadurunge.
KAND mengaruhi mikrotubulus kortikal, filamen aktin, lan viabilitas sel BY-2 tembakau.(a) Visualisasi mikrotubulus kortikal ing sel BY-2 ing ngarsane TagRFP-TUA6.Sel BY-2 sing diobati karo KAND 11 (50 μM utawa 100 μM) utawa DMSO diteliti kanthi mikroskop confocal.Kapadhetan mikrotubulus kortikal diitung saka mikrograf saka 25 sel independen.Huruf nuduhake beda sing signifikan (test Tukey HSD, p<0,05).Skala bar = 10 µm.(b) Filamen aktin kortikal ing sel BY-2 digambarake ing ngarsane GFP-ABD2.Sel BY-2 sing diobati karo KAND 11 (50 μM utawa 100 μM) utawa DMSO diteliti kanthi mikroskop confocal.Kapadhetan filamen aktin kortikal diitung saka mikrograf saka 25 sel independen.Huruf nuduhake beda sing signifikan (test Tukey HSD, p<0,05).Skala bar = 10 µm.(c) Pengamatan sel BY-2 mati kanthi pewarnaan biru Evans.Sel BY-2 sing diobati karo KAND 11 (50 μM utawa 100 μM) utawa DMSO diteliti kanthi mikroskop lapangan sing padhang.n=3.Skala bar = 100 µm.
Panemuan lan aplikasi produk alami anyar wis nyebabake kemajuan sing signifikan ing macem-macem aspek urip manungsa, kalebu obat-obatan lan tetanèn.Riset sejarah wis ditindakake kanggo entuk senyawa sing migunani saka sumber daya alam.Utamane, actinomycetes dikenal migunani minangka antibiotik antiparasit kanggo nematoda amarga kemampuane ngasilake macem-macem metabolit sekunder kayata avermectin, senyawa timbal saka ivermectin lan bleomycin lan turunane, digunakake medicinally minangka agen antikanker21,22.Kajaba iku, macem-macem senyawa herbisida ditemokake saka actinomycetes, sawetara sing wis digunakake sacara komersial1,23.Mulane, analisis metabolit actinomycete kanggo ngisolasi produk alami kanthi aktivitas biologi sing dikarepake dianggep minangka strategi sing efektif.Ing panliten iki, kita nemokake senyawa anyar, coumamonamide, saka S. werraensis lan kasil nyintesis.Asam ursonic minangka perantara sintetik saka urbenamide lan turunane.Bisa nyebabake curling oyod sing khas, nuduhake aktivitas herbisida sing moderat nganti kuwat, lan langsung utawa ora langsung ngrusak mikrotubulus tanduran.Nanging, mekanisme tumindak asam urmotonat bisa uga beda karo inhibitor mikrotubulus sing ana, amarga KAND 11 uga ngganggu filamen aktin lan nyebabake pati sel, nyaranake mekanisme regulasi ing ngendi asam urmotonik lan turunane mengaruhi macem-macem struktur sitoskeletal..
Karakterisasi asam urbenonik sing luwih rinci bakal mbantu luwih ngerti mekanisme tumindak asam urbenonik.Utamane, tujuan sabanjure yaiku kanggo ngevaluasi kemampuan asam ursonic kanggo ikatan karo mikrotubulus sing dikurangi kanggo nemtokake manawa asam ursonik lan turunane tumindak langsung ing mikrotubulus lan depolymerize, utawa apa tumindak kasebut nyebabake destabilisasi mikrotubulus.Kajaba iku, ing kasus mikrotubulus ora dadi target langsung, ngenali situs tumindak lan target molekul asam ursonik ing sel tanduran bakal mbantu luwih ngerti sifat senyawa sing ana gandhengane lan cara sing bisa nambah aktivitas herbisida.Uji bioaktivitas kita nuduhake kemampuan sitotoksik unik asam ursonik ing tuwuhing tanduran kayata Arabidopsis thaliana, tembakau lan lumut ati, dene sel E. coli lan HeLa ora kena pengaruh.Sithik utawa ora ana racun kanggo sel kewan minangka kauntungan saka turunan asam ursonik yen dikembangake minangka herbisida kanggo digunakake ing lapangan tetanèn.Pancen, amarga mikrotubulus minangka struktur umum ing eukariota, inhibisi selektif ing tanduran minangka syarat utama kanggo herbisida.Contone, propyzamide, agen depolymerizing microtubule sing langsung ngiket tubulin lan nyegah polimerisasi, digunakake minangka herbisida amarga toksisitas kurang kanggo sel kewan24.Beda karo disopyramide, benzamida sing gegandhengan duwe kekhususan target sing beda.Saliyane mikrotubulus tanduran, RH-4032 utawa benzoxamide uga nyegah mikrotubulus saka sel kewan utawa oomycetes, lan zalilamide digunakake minangka fungisida amarga fitotoxicity kurang25,26,27.Bear sing mentas ditemokake lan turunane nuduhake sitotoksisitas selektif marang tetanduran, nanging perlu dicathet yen modifikasi luwih lanjut bisa ngowahi spesifik target, sing bisa nyedhiyakake turunan tambahan kanggo ngontrol jamur patogen utawa oomycetes.
Sifat unik asam urbenonik lan turunane migunani kanggo pangembangane minangka herbisida lan digunakake minangka alat riset.Pentinge sitoskeleton kanggo ngontrol wangun sel tanduran diakoni sacara luas.Panaliten sadurunge nuduhake yen tanduran wis ngalami evolusi mekanisme kompleks organisasi mikrotubulus kortikal kanthi ngontrol dinamika mikrotubulus kanggo ngontrol morfogenesis kanthi bener.Akeh molekul sing tanggung jawab kanggo ngatur aktivitas microtubule wis diidentifikasi, lan riset sing gegandhengan isih ditindakake3,4,28.Pemahaman saiki babagan dinamika microtubule ing sel tanduran ora nerangake kanthi lengkap mekanisme organisasi microtubule kortikal.Contone, sanajan loro disopyramide lan oryzalin bisa depolymerize microtubules, disopyramide nyebabake distorsi oyod abot nalika oryzalin duwe efek sing relatif entheng.Kajaba iku, mutasi ing tubulin, sing nyetabilake microtubule, uga nyebabake dextrorotation ing werna, dene paclitaxel, sing uga nyetabilake dinamika microtubule, ora.Mulane, sinau lan ngenali target molekuler asam ursolic kudu menehi wawasan anyar babagan regulasi mikrotubulus kortikal tanduran.Mangkono uga, mbandhingake bahan kimia ing mangsa ngarep sing efektif kanggo ningkatake wutah sing kleru, kayata disopyramide, lan bahan kimia sing kurang efektif, kayata oryzalin utawa asam kumamotoric, bakal menehi pitunjuk babagan pertumbuhan sing kleru.
Ing sisih liya, pangaturan ulang sitoskeletal sing ana gandhengane karo pertahanan minangka kemungkinan liya kanggo nerangake sitotoksisitas asam ursonic.Infèksi patogen utawa introduksi elicitor menyang sel tanduran kadhangkala nyebabake karusakan saka sitoskeleton lan mati sel sakteruse29.Contone, cryptoxanthin sing asale saka oomycete wis dilaporake ngganggu mikrotubulus lan filamen aktin sadurunge mati sel tembakau, padha karo perawatan KAND30,31.Persamaan antarane respon pertahanan lan respon seluler sing diakibatake dening asam ursonat ndadékaké kita nganggep hipotesis yèn padha micu pangolahan seluler sing umum, sanajan efek asam ursonik sing luwih cepet lan kuwat tinimbang cryptoxanthin katon.Nanging, panliten nuduhake manawa gangguan filamen aktin nyebabake pati sel spontan, sing ora mesthi diiringi gangguan mikrotubulus29.Kajaba iku, isih kudu dideleng apa patogen utawa elicitor nyebabake wutah oyod sing kleru, kaya derivatif asam ursonik.Mangkono, kawruh molekuler ngubungake respon pertahanan lan sitoskeleton minangka masalah sing menarik kanggo ditangani.Kanthi eksploitasi anané senyawa bobot molekul sing kurang sing ana hubungane karo asam ursonic, uga sawetara turunan kanthi potensi sing beda-beda, bisa uga menehi kesempatan kanggo target mekanisme seluler sing ora dingerteni.
Digabungake, panemuan lan aplikasi senyawa anyar sing ngowahi dinamika microtubule bakal nyedhiyakake cara sing kuat kanggo ngatasi mekanisme molekuler kompleks sing ndasari tekad wangun sel tanduran.Ing konteks iki, asam urmotonat senyawa sing bubar dikembangake, sing mengaruhi mikrotubulus lan filamen aktin lan nyebabake pati sel, bisa menehi kesempatan kanggo nemtokake sambungan antarane kontrol mikrotubulus lan mekanisme liyane kasebut.Mangkono, analisis kimia lan biologi nggunakake asam urbenonik bakal mbantu kita ngerti mekanisme pangaturan molekuler sing ngontrol sitoskeleton tanduran.
Inoculate S. werraensis MK493-CF1 menyang labu Erlenmeyer baffled 500 mL sing ngemot 110 mL medium biji sing kasusun saka 2% (w/v) galaktosa, 2% (w/v) pasta esensi, 1% ( b/v) komposisi Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w / v) ekstrak jagung (KOGOSTCH Co., Ltd., Jepang), 0,2% (w / v) (NH4) 2SO4 lan 0,2% CaCO3 ing banyu deionized.(pH 7,4 sadurunge sterilisasi).Kultur wiji kasebut diinkubasi ing shaker rotary (180 rpm) ing suhu 27 ° C suwene 2 dina.Budidaya produksi liwat fermentasi solid state.Kultur wiji (7 ml) ditransfer menyang labu K-1 500 ml sing ngemot 40 g medium produksi sing kasusun saka 15 g barley sing ditekan (MUSO Co., Ltd., Jepang) lan 25 g banyu deionisasi (pH ora diatur. sadurunge sterilisasi).).Fermentasi ditindakake ing suhu 30 ° C ing peteng sajrone 14 dina.Bahan fermentasi diekstraksi nganggo 40 ml / botol EtOH lan disentrifugasi (1500 g, 4 ° C, 10 menit).Supernatan kultur (60 ml) diekstraksi kanthi campuran 10% MeOH/EtOAc.Lapisan organik diuapaké ing tekanan sing dikurangi kanggo entuk residu (59,5 mg), sing ditindakake HPLC kanthi elusi gradien (0-10 menit: 90%) ing kolom fase mundur (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × dawa 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 menit: 90% H2O/CH3CN nganti 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 menit: 90% H2O/EtOH, 45–155 menit: 90% H2O / EtOH nganti 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) kanthi laju aliran 1,5 ml / min, coumamonamide (1, 36,0 mg) diisolasi minangka bubuk amorf putih.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nilai sing diwilang: 141,0659, nilai sing diukur: 141,0663, IR νmaks 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1538 cm
Wiji Columbia (Col-0) dipikolehi saka Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) kanthi ijin kanggo nggunakake riset.Wiji Col-0 disebarake lan dijaga ing kahanan laboratorium lan digunakake minangka tanduran Arabidopsis jinis liar.Wiji Arabidopsis disterilisasi ing permukaan lan dibudidaya ing medium Murashige lan Skoog setengah kekuatan sing ngandhut sukrosa 2% (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) ( Fujifilm Wako Pure Chemical ).) lan 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, ing 23 °C lan cahya konstan.Wiji saka mutan phs1-1 diwenehake dening T. Hashimoto (Institut Sains lan Teknologi Nara).
Wiji galur SR-1 diwenehake dening T. Hashimoto (Institut Sains lan Teknologi Nara) lan digunakake minangka tanduran tembakau jinis liar.Wiji tembakau disterilisasi lumahing lan direndhem ing banyu steril suwene telung bengi kanggo ningkatake germination, banjur dilebokake ing larutan setengah kekuatan sing ngandhut 2% sukrosa, 0,05% (w/v) MES, lan 0,8% permen karet gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.lan medium Skoog) kanthi pH 5,7 lan diinkubasi ing 23 ° C ing cahya sing konstan.
Strain Tak-1 diwenehake dening T. Kohchi (Universitas Kyoto) lan digunakake minangka unit eksperimen standar kanggo sinau liverwort.Gemma dijupuk saka tanduran sing wis disterilisasi banjur dilapisi ing medium Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) sing ngemot 1% sukrosa lan 0,3% permen gellan lan diinkubasi ing suhu 23 ° C kanthi cahya sing terus-terusan.
Sel Tembakau BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Kuning Cerah 2) diwenehake dening S. Hasezawa (Universitas Tokyo).Sèl BY-2 diencerke 95 kali ing medium Linsmeier lan Skoog sing dimodifikasi lan ditambah saben minggu karo asam 2,4-diklorofenoksiasetat 32.Suspensi sel dicampur ing shaker rotary ing 130 rpm ing 27 ° C ing peteng.Cuci sel kanthi volume 10 kaping volume medium seger lan resuspend ing medium padha.Garis sel transgenik BY-2 kanthi stabil nyatakake marker microtubule TagRFP-TUA6 utawa penanda filamen aktin GFP-ABD2 ing sangisore promotor virus mozaik kembang kol 35S digawe kaya sing diterangake33,34,35.Garis sel iki bisa dijaga lan disinkronake nggunakake prosedur sing padha karo sing digunakake kanggo garis sel BY-2 asli.
Sel HeLa dibudidayakan ing medium Eagle Modified Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) ditambah karo 10% serum sapi janin, 1.2 U / ml penisilin, lan 1.2 μg / ml streptomycin ing inkubator 37 ° C kanthi 5% CO2.
Kabeh eksperimen sing diterangake ing naskah iki ditindakake miturut peraturan lan pedoman biosafety Jepang.
Senyawa dibubarake ing dimetil sulfoksida (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) minangka solusi saham lan diencerke ing medium MS kanggo Arabidopsis lan tembakau utawa medium Gamborg B5 kanggo liverwort.Kanggo uji inhibisi pertumbuhan oyod, luwih saka 10 wiji saben piring disebar ing medium agar sing ngemot senyawa sing dituduhake utawa DMSO.Wiji di inkubasi ing kamar wutah suwene 7 dina.Bibit difoto lan dawane oyod diukur.Kanggo uji perkecambahan Arabidopsis, 48 wiji saben piring ditabur ing medium agar sing ngemot senyawa 200 μM utawa DMSO.Wiji Arabidopsis ditanem ing kamar wutah lan jumlah tunas sing dikecambah diitung 7 dina sawise germination (dag).Kanggo uji perkecambahan tembakau, 24 wiji saben piring ditabur ing medium agar sing ngemot 200 μM KAND utawa DMSO.Wiji tembakau ditanem ing kamar wutah lan jumlah tunas sing germination diitung sawise 14 dina.Kanggo uji inhibisi pertumbuhan liverwort, 9 embrio saka saben piring dilapisi ing medium agar sing ngemot konsentrasi KAND utawa DMSO sing dituduhake lan diinkubasi ing kamar pertumbuhan suwene 14 dina.
Gunakake tunas sing diwarnai karo 5 mg / ml propidium iodide (PI) kanggo nggambarake organisasi meristem akar.Sinyal PI diamati kanthi mikroskop fluoresensi nggunakake mikroskop scanning laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Pewarnaan histokimia saka werna kanthi β-glucuronidase (GUS) ditindakake miturut protokol sing diterangake dening Malami lan Benfey36.Bibit diencerake ing aseton 90% ing wayah wengi, diwarnai kanthi 0,5 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid ing buffer GUS suwene 1 jam lan dilebokake ing larutan kloraldehida sing dihidrasi.(8 g kloral hidrat, 2 ml banyu lan 1 ml gliserol) lan diamati kanthi mikroskop kontras interferensi diferensial nggunakake mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Sudut ROOT diukur ing tunas umur 7 dina sing ditanam ing piring vertikal.Ukur sudut akar saka arah vektor gravitasi kaya sing diterangake ing langkah 6.
Susunan mikrotubulus kortikal diamati kaya sing diterangake, kanthi modifikasi cilik ing protokol 37.Antibodi anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) lan Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) digunakake minangka antibodi primer lan sekunder ing pengenceran 1:1000 lan 1:100, mungguh.Gambar fluoresensi dipikolehi nggunakake mikroskop scanning laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).Entuk gambar Z-tumpukan lan gawe proyeksi intensitas maksimal miturut instruksi pabrikan.
Assay proliferasi sel HeLa ditindakake kanthi nggunakake Cell Counting Kit 8 (Dojindo) miturut pandhuan pabrikan.
Wutah E. coli DH5α dianalisis kanthi ngukur kapadhetan sel ing kultur nggunakake spektrofotometer ing 600 nm (OD600).
Organisasi sitoskeletal ing sel BY-2 transgenik diamati nggunakake mikroskop fluoresensi sing dilengkapi piranti pemindai confocal CSU-X1 (Yokogawa) lan kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology).Kapadhetan sitoskeletal ditaksir kanthi analisis gambar, sing ngitung persentase piksel sitoskeletal ing antarane piksel sitoplasma ing gambar confocal nggunakake piranti lunak ImageJ minangka diterangake38,39.
Kanggo ndeteksi pati sel ing sel BY-2, aliquot saka suspensi sel diinkubasi karo 0,05% Evans biru kanggo 10 menit ing suhu kamar.Pewarnaan biru Evans sel mati gumantung saka ekstrusi pewarna saka sel sing bisa urip kanthi membran plasma sing utuh40.Sel sing diwarnai diamati nggunakake mikroskop lapangan padhang (BX53, Olympus).
Sel HeLa ditanam ing DMEM ditambah karo 10% FBS ing inkubator sing dilembabake ing 37 ° C lan 5% CO2.Sel diobati karo 100 μM KAND 11, asam kumamonamat 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), utawa 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) kanggo 6 jam ing 37 ° C.Sel kasebut diatasi karo MetOH kanggo 10 menit lan banjur karo asetat kanggo 5 menit ing suhu kamar.Sel tetep diinkubasi karo antibodi primer β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diencerke ing 0,5% BSA / PBS suwene 2 jam, dicuci kaping 3 nganggo TBST, banjur diinkubasi karo antibodi kambing Alexa Fluor.4881 jam.- Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) lan 15 ng / ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) diencerke ing 0,5% BSA / PBS.Sawise ngumbah nganggo TBST kaping telu, sel sing diwarnai diamati ing mikroskop terbalik Nikon Eclipse Ti-E.Gambar dijupuk nganggo kamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 sing digawe adhem nggunakake piranti lunak MetaMorph (Piranti Molekuler).
Wektu kirim: Jun-17-2024