Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo asil sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake versi browser sing luwih anyar (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita nampilake situs tanpa gaya utawa JavaScript.
Panemon lan panggunaan produk alami sing migunani bisa mbantu ningkatake kualitas urip manungsa. Bahan kimia penghambat pertumbuhan tanduran digunakake sacara wiyar minangka herbisida kanggo ngontrol gulma. Amarga kabutuhan kanggo nggunakake macem-macem jinis herbisida, ana kabutuhan kanggo ngenali senyawa kanthi mekanisme aksi anyar. Ing panliten iki, kita nemokake senyawa N-alkoxypyrrole anyar, coumamonamide, saka Streptomyces werraensis MK493-CF1 lan netepake proses sintesis sing lengkap. Liwat uji aktivitas biologis, kita nemokake yen asam urs-monoamat minangka perantara sintetik saka urs-monoamid lan potensial.inhibitor pertumbuhan tanamanKajaba iku, kita wis ngembangake macem-macem turunan asam urbenonat, kalebu turunan urbenyloxy (UDA), sing nduweni aktivitas herbisida sing dhuwur tanpa mengaruhi pertumbuhan sel HeLa kanthi negatif. Kita uga nemokake yen turunan asam urmotonat ngganggu mikrotubulus tanduran; saliyane iku, KAND mengaruhi filamen aktin lan nyebabake pati sel; Efek multifaset iki beda karo inhibitor mikrotubulus sing dikenal lan menehi saran mekanisme aksi anyar kanggo asam ursonat, sing makili kauntungan penting ing pangembangan herbisida anyar.
Panemon lan aplikasi praktis saka produk alami sing migunani lan turunane minangka sarana kanggo ningkatake kualitas urip manungsa. Metabolit sekunder sing diasilake dening mikroorganisme, tanduran, lan serangga wis nyebabake kemajuan gedhe ing babagan kedokteran lan pertanian. Akeh antibiotik lan obat anti-leukemia sing wis dikembangake saka produk alami. Kajaba iku, macem-macem jinispestisida, fungisida lan herbisida diekstrak saka produk alami iki kanggo digunakake ing tetanèn. Utamane, herbisida kontrol gulma minangka alat penting kanggo nambah asil panen ing tetanèn modern, lan macem-macem jinis senyawa wis digunakake sacara komersial. Sawetara proses seluler ing tanduran, kayata fotosintesis, metabolisme asam amino, sintesis dinding sel, regulasi mitosis, sinyal fitohormon, utawa sintesis protein, dianggep minangka target khas herbisida. Senyawa sing nyegah fungsi mikrotubulus minangka kelas herbisida umum sing mengaruhi pertumbuhan tanduran kanthi mengaruhi regulasi mitosis2.
Mikrotubulus minangka komponen sitoskeleton lan akeh disimpen ing sel eukariotik. Heterodimer tubulin kasusun saka α-tubulin lan β-tubulin sing mbentuk protofilamen mikrotubulus linier, kanthi 13 protofilamen sing mbentuk struktur silinder. Mikrotubulus nduweni pirang-pirang peran ing sel tanduran, kalebu nemtokake bentuk sel, pembelahan sel, lan transportasi intraseluler3,4. Sel tanduran ngemot mikrotubulus ing sangisore membran plasma interfase, lan mikrotubulus kortikal iki dianggep ngontrol organisasi mikrofibril selulosa liwat regulasi kompleks selulosa sintase4,5. Mikrotubulus kortikal sel epidermal oyot, sing ana ing zona pemanjangan cepet pucuk oyot, dumunung ing sisih lateral, lan serat mikro selulosa ngetutake mikrotubulus iki lan mbatesi arah ekspansi sel, saengga ningkatake pemanjangan sel anisotropik. Mulane, fungsi mikrotubulus ana hubungane karo morfologi tanduran. Substitusi asam amino ing gen sing ngode tubulin nyebabake kemiringan susunan mikrotubulus kortikal lan pertumbuhan sisih kiwa utawa tengen ing Arabidopsis 6,7. Kajaba iku, mutasi ing protein sing ana gandhengane karo mikrotubulus sing ngatur dinamika mikrotubulus uga bisa nyebabake pertumbuhan oyot sing terdistorsi8,9,10,11,12,13. Kajaba iku, perawatan nganggo herbisida sing ngganggu mikrotubulus kayata disopyramide, uga dikenal minangka pretilachlor, uga nyebabake pertumbuhan oyot miring sisih kiwa14. Data kasebut nuduhake yen regulasi fungsi mikrotubulus sing tepat penting banget kanggo nemtokake arah pertumbuhan tanduran.
Maneka warna jinis inhibitor mikrotubulus wis ditemokake, lan obat-obatan kasebut wis menehi kontribusi sing signifikan kanggo riset sitoskeletal, uga kanggo tetanèn lan obat-obatan2. Utamane, oryzalin, senyawa dinitroanilin, disopiramid, senyawa sing ana gandhengane karo benzamida, lan analoge bisa nyegah fungsi mikrotubulus lan kanthi mangkono nyegah pertumbuhan tanduran. Mulane, dheweke akeh digunakake minangka herbisida. Nanging, amarga mikrotubulus minangka komponen penting saka sel tanduran lan kewan, umume inhibitor mikrotubulus sitotoksik kanggo kaloro jinis sel kasebut. Mulane, sanajan wis diakoni minangka herbisida, sawetara agen antimikrotubulus digunakake kanggo tujuan praktis.
Streptomyces iku sawijining genus saka kulawarga Streptomyces, sing kalebu bakteri aerobik, gram-positif, lan filamen, lan dikenal amarga kemampuane kanggo ngasilake macem-macem metabolit sekunder. Mulane, iki dianggep minangka salah sawijining sumber produk alami aktif biologis anyar sing paling penting. Ing panliten saiki, kita nemokake senyawa anyar sing diarani coumamonamide, sing diisolasi saka Streptomyces werraensis MK493-CF1 lan S. werraensis ISP 5486. Nggunakake analisis spektral lan analisis spektral lengkap, struktur coumamonamide dikarakterisasi lan kerangka N-alkoxypyrrole sing unik ditemtokake. sintesis. Asam Ursmonat, zat antara sintetis saka ursmonoamide lan turunane, ditemokake bisa nyegah pertumbuhan lan perkecambahan tanduran model populer Arabidopsis thaliana. Ing panliten hubungan struktur-aktivitas, kita nemokake manawa senyawa karo C9 sing dimodifikasi dadi asam ursonat, sing diarani turunan nonyloxy saka asam ursonat (KAND), kanthi signifikan nambah efek penghambatan ing pertumbuhan lan perkecambahan. Khususé, inhibitor pertumbuhan tanduran sing nembe ditemokake uga mengaruhi pertumbuhan tembakau lan lumut ati lan ora sitotoksik kanggo bakteri utawa sel HeLa. Kajaba iku, sawetara turunan asam urmotonat nyebabake fenotipe oyot sing kleru, sing nuduhake yen turunan kasebut langsung utawa ora langsung mengaruhi mikrotubulus. Konsisten karo ide iki, pengamatan kita babagan mikrotubulus sing diwenehi label kanthi imunohistokimia utawa protein fluoresen nuduhake yen perawatan KAND depolimerisasi mikrotubulus. Kajaba iku, perawatan nganggo turunan asam kumamotonat ngganggu mikrofilamen aktin. Mangkono, kita wis nemokake inhibitor pertumbuhan tanduran anyar sing mekanisme aksi unik kalebu karusakan sitoskeleton.
Galur MK493-CF1 diisolasi saka lemah ing Shinagawa-ku, Tokyo. Galur MK493-CF1 mbentuk miselium stroma sing bercabang apik. Urutan parsial gen RNA ribosom 16S (1422 bp) ditemtokake. Galur iki meh padha karo S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: galur khas, 99,93%). Adhedhasar asil iki, ditemtokake manawa galur iki raket banget karo jinis galur S. werraensis. Mulane, kita menehi jeneng galur iki S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T uga ngasilake senyawa bioaktif sing padha. Amarga ana sithik riset awal kanggo entuk produk alami saka mikroorganisme iki, riset kimia luwih lanjut ditindakake. Sawisé budidaya S. werraensis MK493-CF1 ing medium barley kanthi fermentasi solid-state ing suhu 30°C sajrone 14 dina, medium kasebut diekstrak nganggo 50% EtOH. 60 ml sampel dikeringake kanggo entuk 59,5 mg ekstrak kasar. Ekstrak kasar kasebut diekstrak nganggo HPLC fase terbalik kanggo ngasilake N-metoksi-1H-pirola-2-karboksamida (1, jenenge kuumamonamida, 36,0 mg). Jumlah total 1 kira-kira 60% saka ekstrak kasar. Mulane, kita mutusake kanggo nyinaoni kanthi rinci babagan sifat-sifat kumamotoamida 1.
Kumamonamida 1 iku bubuk amorf putih lan spektrometri massa resolusi dhuwur (HRESIMS) ngonfirmasi C6H8N2O2 (Gambar 1). Fragmen pirol sing disubstitusi C2 saka senyawa iki ditondoi dening δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH ing spektrum 1H NMR: 4,5 Hz, H-5) lan δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), lan spektrum 13C NMR nuduhake anané papat atom karbon sp2. Anané gugus amida ing posisi C2 ditaksir kanthi korelasi HMBC saka proton C-3 menyang karbon karbonil amida ing δC 161,1. Saliyané iku, puncak 1 H lan 13 C NMR ing δH 4.10 (3H, S) lan δC 68.3 nuduhaké anané gugus N-metoksi ing molekul kasebut. Sanajan posisi gugus metoksi sing bener durung ditemtokake nggunakaké analisis spektroskopi kaya ta spektroskopi diferensial sing ditingkataké lan singkatan Overhauser nuklir (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamida dadi senyawa kandidat pisanan.
Kanggo nemtokake struktur 1 sing bener, sintesis total ditindakake (Gambar 2a). Perawatan 2-aminopyridine 2 sing kasedhiya sacara komersial nganggo m-CPBA ngasilake N-oksida 3 sing cocog ing asil kuantitatif. Sawise 2-aminoazidasi 2, reaksi siklokondensasi sing diterangake dening Abramovich ditindakake ing benzena ing suhu 90°C kanggo entuk 1-hidroksi-1H-pirola-2-karbonitril 5 sing dikarepake ing gram. Kacepetan 60% (rong tahap). 15,16. Metilasi lan hidrolisis 4 banjur ngasilake 1-metoksi-1H-pirola-2-asam karboksilat (disebut "asam kumotonat", 6) kanthi asil sing apik (70%, rong langkah). Pungkasan, amidasi liwat perantara asam klorida 6 nggunakake amonia banyu menehi Kumamoto amida 1 kanthi asil 98%. Kabeh data spektral saka 1 sing disintesis padha karo 1 sing diisolasi, mula struktur 1 ditemtokake;
Sintesis umum lan analisis aktivitas biologis urbenamide lan asam urbenat. (a) Sintesis total amida Kumamoto. (b) Bibit Arabidopsis Columbia (Col) tipe liar umur pitung dina ditandur ing piring Murashige lan Skoog (MS) sing ngemot coumamonamide 6 utawa coumamonamide 1 ing konsentrasi sing dituduhake. Bar skala = 1 cm.
Kapisan, kita ngevaluasi aktivitas biologis urbenamide lan zat antara kanggo kemampuane kanggo ngatur pertumbuhan tanduran. Kita nambahake macem-macem konsentrasi ursmonamide 1 utawa asam ursmonat 6 menyang medium agar MS lan tunas Arabidopsis thaliana sing dikultur ing medium iki. Uji coba iki nuduhake yen konsentrasi dhuwur (500 μM) saka 6 nyegah pertumbuhan oyot (Gambar 2b). Sabanjure, kita ngasilake macem-macem turunan kanthi ngganti posisi N1 saka 6 lan nindakake studi hubungan struktur-aktivitas ing kana (proses sintesis analog diterangake ing Informasi Pendukung (SI)). Bibit Arabidopsis ditandur ing medium sing ngemot 50 μM turunan asam ursonat, lan dawa oyot diukur, kaya sing dituduhake ing gambar. Kaya sing dituduhake ing Gambar 3a, b, lan S1, asam coumamo duwe dawa rantai alkoksi linier (9, 10, 11, 12, lan 13) utawa rantai alkoksi gedhe (15, 16, lan 17) sing beda ing posisi N1. Turunan kasebut nuduhake inhibisi pertumbuhan oyot sing signifikan. Kajaba iku, kita nemokake yen aplikasi 200 μM 10, 11, utawa 17 nyegah perkecambahan (Gambar 3c lan S2).
Panliten babagan hubungan struktur-aktivitas amida Kumamoto lan senyawa sing gegandhengan. (a) Skema struktur lan sintesis analog. (b) Kuantifikasi dawa oyot tunas umur 7 dina sing ditandur ing medium MS nganggo utawa tanpa turunan kumamonamide 50 μM. Tandha asterisk nuduhake beda sing signifikan karo perawatan palsu (uji t, p< 0.05). n>18. Data dituduhake minangka rata-rata ± SD. nt tegese "durung dites" amarga luwih saka 50% wiji ora thukul. (c) Kuantifikasi tingkat perkecambahan wiji sing diobati sing diinkubasi sajrone 7 dina ing medium MS nganggo utawa tanpa 200 μM coumamonamide lan senyawa sing gegandhengan. Tandha asterisk nuduhake beda sing signifikan karo perawatan palsu (tes chi-kuadrat). n=96.
Menariknya, penambahan rantai samping alkil sing luwih dawa tinimbang C9 nyuda aktivitas penghambatan, sing nuduhake yen senyawa sing ana gandhengane karo asam kumamotoat mbutuhake rantai samping kanthi ukuran tartamtu kanggo nuduhake aktivitas biologis.
Amarga analisis hubungan struktur-aktivitas nuduhake yen C9 dimodifikasi dadi asam ursonat lan turunan noniloksi saka asam ursonat (sabanjure diarani KAND 11) minangka inhibitor pertumbuhan tanduran sing paling efektif, kita nindakake karakterisasi KAND 11 sing luwih rinci. Perawatan Arabidopsis nganggo 50 μM KAND 11 meh kabeh nyegah perkecambahan, dene konsentrasi KAND 11 sing luwih murah (40, 30, 20, utawa 10 μM) nyegah pertumbuhan oyot kanthi cara sing gumantung dosis (Gambar 4a, b). Kanggo nguji apa KAND 11 mengaruhi kelangsungan urip meristem oyot, kita mriksa meristem oyot sing diwarnai nganggo propidium iodida (PI) lan ngukur ukuran area meristem. Ukuran meristem tunas sing ditandur ing medium sing ngandhut 25 μM KAND-11 yaiku 151,1 ± 32,5 μm, dene ukuran meristem tunas sing ditandur ing medium kontrol sing ngandhut DMSO yaiku 264,7 ± 30,8 μm (Gambar 4c, d), sing nuduhake yen KAND-11 mulihake aktivitas seluler. panyebaran. Meristem oyot. Konsisten karo iki, perawatan KAND 11 nyuda jumlah sinyal penanda divisi sel CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ing meristem oyot (Gambar 4e) 17. Asil kasebut nuduhake yen KAND 11 nyegah pertumbuhan oyot kanthi nyuda aktivitas proliferasi sel.
Analisis efek penghambatan turunan asam urbenonat (turunan urbenyloksi) marang pertumbuhan. (a) Bibit Col tipe liar umur 7 dina sing ditandur ing piring MS kanthi konsentrasi KAND 11 sing dituduhake. Bar skala = 1 cm. (b) Kuantifikasi dawa oyot. Huruf nuduhake beda sing signifikan (tes Tukey HSD, p< 0.05). n>16. Data dituduhake minangka rata-rata ± SD. (c) Mikroskopi confocal saka oyot Col tipe liar sing diwarnai propidium iodida sing thukul ing piring MS nganggo utawa tanpa 25 μM KAND 11. Kurung putih nuduhake meristem oyot. Bar skala = 100 µm. (d) Kuantifikasi ukuran meristem oyot (n = 10 nganti 11). Bedane statistik ditemtokake nggunakake uji-t (p< 0,05). Batang-batang kasebut nggambarake ukuran meristem rata-rata. (e) Mikroskopi kontras interferensi diferensial (DIC) saka meristem oyot sing ngemot konstruksi CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS diwarnai lan diwarnai ing tunas umur 5 dina sing ditandur ing piring MS nganggo utawa tanpa uji KAND 25 µM.
Fitotoksisitas KAND 11 diuji luwih lanjut nggunakake tanduran dikotil liyane, yaiku tembakau (Nicotiana tabacum), lan organisme model tanduran darat utama, lumut ati (Marchantia polymorpha). Kaya ing kasus Arabidopsis, tunas tembakau SR-1 sing ditandur ing medium sing ngemot 25 μM KAND 11 ngasilake oyot sing luwih cendhek (Gambar 5a). Kajaba iku, 40 saka 48 wiji thukul ing piring sing ngemot 200 μM KAND 11, dene kabeh 48 wiji thukul ing media sing diolah tiruan, nuduhake yen konsentrasi KAND sing luwih dhuwur signifikan (p< 0,05; uji chi -square) nyegah perkecambahan tembakau. (Gambar 5b). Kajaba iku, konsentrasi KAND 11 sing nyegah pertumbuhan bakteri ing lumut ati padha karo konsentrasi efektif ing Arabidopsis (Gambar 5c). Asil kasebut nuduhake yen KAND 11 bisa nyegah pertumbuhan macem-macem tanduran. Banjur kita nyelidiki kemungkinan sitotoksisitas senyawa sing ana gandhengane karo monoamida beruang ing organisme liyane, yaiku sel HeLa manungsa lan galur Escherichia coli DH5α, minangka wakil saka sel kewan lan bakteri sing luwih dhuwur. Ing seri uji proliferasi sel, kita mirsani yen coumamonamide 1, asam coumamonamidat 6, lan KAND 11 ora mengaruhi pertumbuhan sel HeLa utawa E. coli ing konsentrasi 100 μM (Gambar 5d, e).
Inhibisi pertumbuhan KAND 11 ing organisme non-Arabidopsis. (a) Bibit tembakau SR-1 tipe liar umur rong minggu ditandur ing piring MS sing dipasang vertikal sing ngemot 25 μM KAND 11. (b) Bibit tembakau SR-1 tipe liar umur rong minggu ditandur ing piring MS sing dipasang horisontal sing ngemot 200 μM KAND 11. (c) Tunas lumut ati Tak-1 tipe liar umur rong minggu sing ditandur ing piring Gamborg B5 kanthi konsentrasi KAND 11 sing dituduhake. Panah abang nuduhake spora sing mandheg tuwuh sajrone periode inkubasi rong minggu. (d) Uji proliferasi sel sel HeLa. Jumlah sel sing urip diukur ing interval wektu tetep nggunakake kit penghitungan sel 8 (Dojindo). Minangka kontrol, sel HeLa diobati nganggo 5 μg/ml aktinomisin D (Act D), sing nyegah transkripsi RNA polimerase lan nyebabake pati sel. Analisis ditindakake kaping telu. (e) Uji proliferasi sel E. coli. Pertumbuhan E. coli dianalisis kanthi ngukur OD600. Minangka kontrol, sel diobati nganggo ampisilin (Amp) 50 μg/ml, sing ngalangi sintesis dinding sel bakteri. Analisis ditindakake kaping telu.
Kanggo mangerteni mekanisme aksi sitotoksisitas sing disebabake dening senyawa sing ana gandhengane karo uramide, kita nganalisa maneh turunan asam urbenat kanthi efek penghambatan moderat, kaya sing dituduhake ing gambar. Kaya sing dituduhake ing Gambar 2b, 6a, tunas sing ditandur ing piring agar sing ngemot konsentrasi dhuwur (200 μM) asam urmotonat 6 ngasilake oyot sing luwih cendhek lan mlengkung kiwa (θ = – 23,7 ± 6,1), dene tunas sing ditandur ing medium kontrol, tunas ngasilake oyot sing meh lurus (θ = – 3,8 ± 7,1). Pertumbuhan miring sing khas iki dikenal minangka akibat saka disfungsi mikrotubulus kortikal14,18. Konsisten karo temuan iki, obat destabilisasi mikrotubulus disopyramide lan oryzalin nyebabake miring oyot sing padha ing kahanan pertumbuhan kita (Gambar 2b, 6a). Ing wektu sing padha, kita nguji turunan asam urmotonat lan milih sawetara sing, ing konsentrasi tartamtu, nyebabake pertumbuhan oyot miring. Senyawa 8, 9, lan 15 ngowahi arah tuwuhing oyot ing 75 μM, 50 μM, lan 40 μM, masing-masing, nuduhake yen senyawa kasebut bisa kanthi efektif ngrusak stabilitas mikrotubulus (Gambar 2b, 6a). Kita uga nguji turunan asam ursolat sing paling kuat, KAND 11, kanthi konsentrasi sing luwih murah (15 µM) lan nemokake yen aplikasi KAND 11 nyegah tuwuhing oyot lan arah tuwuhing oyot ora rata, sanajan cenderung miring menyang kiwa (Gambar C3). Amarga konsentrasi obat sing luwih dhuwur kanggo ngrusak stabilitas mikrotubulus kadhangkala nyegah tuwuhing tanduran tinimbang nyebabake oyot miring, kita banjur ngira-ira kemungkinan yen KAND 11 mengaruhi mikrotubulus kanthi mirsani mikrotubulus kortikal ing sel epidermal oyot. Imunohistokimia nggunakake antibodi anti-β-tubulin ing sel epidermal oyot tunas sing diobati nganggo 25 μM KAND 11 nuduhake ilang meh kabeh mikrotubulus kortikal ing sel epidermal ing zona elongasi (Gambar 6b). Asil iki nuduhake yen asam kumamotonat lan turunane tumindak langsung utawa ora langsung ing mikrotubulus kanggo ngganggu lan senyawa kasebut minangka inhibitor mikrotubulus anyar.
Asam ursonat lan turunane ngowahi mikrotubulus kortikal ing Arabidopsis thaliana. (a) Sudut inklinasi oyot sing diukur ing ngarsane macem-macem turunan asam urmotonat ing konsentrasi sing dituduhake. Efek saka rong senyawa sing dikenal bisa nyegah mikrotubulus: disopiramid lan oryzalin uga dianalisis. Sisipan nuduhake standar sing digunakake kanggo ngukur sudut pertumbuhan oyot. Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan karo perawatan palsu (uji t, p< 0.05). n>19. Batang skala = 1 cm. (b) Mikrotubulus kortikal ing sel epidermal ing zona elongasi. Mikrotubulus ing oyot Arabidopsis Col tipe liar sing thukul ing piring MS nganggo utawa tanpa 25 μM KAND 11 divisualisasikake kanthi pewarnaan imunohistokimia nggunakake antibodi primer β-tubulin lan antibodi sekunder konjugasi Alexa Fluor. Batang skala = 10 µm. (c) Struktur mitosis mikrotubulus ing meristem oyot. Mikrotubulus divisualisasikake nggunakake pewarnaan imunohistokimia. Struktur mitosis, kalebu zona profase, gelendong, lan fragmoplas, diitung saka gambar confocal. Panah nuduhake struktur mikrotubulus mitosis. Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan karo perawatan palsu (uji t, p< 0.05). n>9. Batang skala = 50 µm.
Senajan Ursa nduweni kemampuan kanggo ngganggu fungsi mikrotubulus, mekanisme kerjane diarepake beda karo agen depolimerisasi mikrotubulus khas. Contone, konsentrasi agen depolimerisasi mikrotubulus sing luwih dhuwur kayata disopyramid lan oryzalin nyebabake ekspansi anisotropik sel epidermal, dene KAND 11 ora. Kajaba iku, aplikasi bebarengan KAND 11 lan disopyramid nyebabake respon pertumbuhan oyot sing diinduksi disopyramid gabungan lan inhibisi pertumbuhan sing diinduksi KAND 11 diamati (Gambar S4). Kita uga nganalisa respon mutan disopyramid 1-1 (phs1-1) hipersensitif marang KAND 11. phs1-1 nduweni mutasi titik tubulin kinase non-kanonik lan ngasilake oyot sing luwih cendhek nalika diobati nganggo disopyramid9,20. Bibit mutan phs1-1 sing ditandur ing medium agar sing ngemot KAND 11 nduweni oyot sing luwih cendhek padha karo sing ditandur ing disopyramid (gambar S5).
Kajaba iku, kita mirsani struktur mikrotubulus mitosis, kayata zona profase, gelendong, lan phragmoplas, ing meristem oyot saka tunas sing diobati nganggo KAND 11. Konsisten karo pengamatan kanggo CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, penurunan jumlah mikrotubulus mitosis sing signifikan diamati (Gambar .6c).
Kanggo nggambarake sitotoksisitas KAND 11 ing resolusi subselular, kita ngolah sel suspensi BY-2 tembakau nganggo KAND 11 lan mirsani respon kasebut. Kita pisanan nambahake KAND 11 menyang sel BY-2 sing ngekspresikan TagRFP-TUA6, sing menehi label mikrotubulus kanthi fluoresensi, kanggo netepake efek KAND 11 ing mikrotubulus kortikal. Kapadhetan mikrotubulus kortikal ditaksir nggunakake analisis gambar, sing ngetung persentase piksel sitoskeletal ing antarane piksel sitoplasma. Asil uji coba nuduhake yen sawise perawatan nganggo 50 μM utawa 100 μM KAND 11 sajrone 1 jam, kapadhetan mudhun sacara signifikan dadi 0,94 ± 0,74% utawa 0,23 ± 0,28%, dene kapadhetan sel sing diobati nganggo DMSO, yaiku 1,61 ± 0,34% (Gambar 7a). Asil kasebut konsisten karo pengamatan ing Arabidopsis yen perawatan KAND 11 nyebabake depolimerisasi mikrotubulus kortikal (Gambar 6b). Kita uga nliti garis BY-2 nganggo filamen aktin sing diwenehi label GFP-ABD sawise perawatan nganggo konsentrasi KAND 11 sing padha lan mirsani manawa perawatan KAND 11 ngganggu filamen aktin. Perawatan nganggo 50 μM utawa 100 μM KAND 11 sajrone 1 jam nyuda kapadhetan filamen aktin kanthi signifikan dadi 1,20 ± 0,62% utawa 0,61 ± 0,26%, dene kapadhetan ing sel sing diobati DMSO yaiku 1,69 ± 0,51% (Gambar 2). 7b). Asil kasebut kontras karo efek propyzamide, sing ora mengaruhi filamen aktin, lan latrunculin B, depolimerisasi aktin sing ora mengaruhi mikrotubulus (Gambar SI S6). Kajaba iku, perawatan nganggo coumamonamide 1, asam coumamonamide 6, utawa KAND 11 ora mengaruhi mikrotubulus ing sel HeLa (Gambar SI S7). Dadi, mekanisme kerja KAND 11 diyakini beda karo pengganggu sitoskeleton sing dikenal. Kajaba iku, pengamatan mikroskopis kita babagan sel BY-2 sing diobati nganggo KAND 11 nuduhake wiwitan pati sel sajrone perawatan KAND 11 lan nuduhake yen proporsi sel mati sing diwarnai biru Evans ora tambah sacara signifikan sawise 30 menit perawatan KAND 11, dene sawise 90 menit perawatan nganggo 50 μM utawa 100 μM KAND, jumlah sel mati tambah dadi 43,7% utawa 80,1%, masing-masing (Gambar 7c). Dijupuk bebarengan, data iki nuduhake yen turunan asam ursolat anyar KAND 11 minangka inhibitor sitoskeleton spesifik tanduran kanthi mekanisme kerja sing sadurunge ora dingerteni.
KAND mengaruhi mikrotubulus kortikal, filamen aktin, lan kelangsungan urip sel BY-2 tembakau. (a) Visualisasi mikrotubulus kortikal ing sel BY-2 kanthi anané TagRFP-TUA6. Sel BY-2 sing diobati nganggo KAND 11 (50 μM utawa 100 μM) utawa DMSO ditliti nganggo mikroskop confocal. Kapadhetan mikrotubulus kortikal diitung saka mikrograf saka 25 sel independen. Huruf nuduhake beda sing signifikan (tes Tukey HSD, p< 0,05). Bar skala = 10 µm. (b) Filamen aktin kortikal ing sel BY-2 divisualisasikake ing ngarsane GFP-ABD2. Sel BY-2 sing diobati nganggo KAND 11 (50 μM utawa 100 μM) utawa DMSO ditliti nganggo mikroskop confocal. Kapadhetan filamen aktin kortikal diitung saka mikrograf saka 25 sel independen. Huruf nuduhake beda sing signifikan (tes Tukey HSD, p< 0,05). Bar skala = 10 µm. (c) Pengamatan sel BY-2 sing mati kanthi pewarnaan biru Evans. Sel BY-2 sing diobati nganggo KAND 11 (50 μM utawa 100 μM) utawa DMSO ditliti nganggo mikroskop medan padhang. n=3. Bar skala = 100 µm.
Panemon lan aplikasi produk alami anyar wis nyebabake kemajuan sing signifikan ing macem-macem aspek urip manungsa, kalebu obat-obatan lan pertanian. Riset historis wis ditindakake kanggo entuk senyawa sing migunani saka sumber daya alam. Utamane, aktinomisetes dikenal migunani minangka antibiotik antiparasit kanggo nematoda amarga kemampuane ngasilake macem-macem metabolit sekunder kayata avermectin, senyawa utama ivermectin lan bleomycin lan turunane, sing digunakake minangka agen antikanker21,22. Kajaba iku, macem-macem senyawa herbisida wis ditemokake saka aktinomisetes, sawetara wis digunakake sacara komersial1,23. Mulane, analisis metabolit aktinomisetes kanggo ngisolasi produk alami kanthi aktivitas biologis sing dikarepake dianggep minangka strategi sing efektif. Ing panliten iki, kita nemokake senyawa anyar, coumamonamide, saka S. werraensis lan kasil nyintesis. Asam ursonic minangka perantara sintetik urbenamide lan turunane. Iki bisa nyebabake keriting oyot sing khas, nuduhake aktivitas herbisida moderat nganti kuwat, lan langsung utawa ora langsung ngrusak mikrotubulus tanduran. Nanging, mekanisme kerja asam urmotonat bisa uga beda karo inhibitor mikrotubulus sing wis ana, amarga KAND 11 uga ngganggu filamen aktin lan nyebabake pati sel, sing nuduhake mekanisme pangaturan sing digunakake asam urmotonat lan turunane kanggo mengaruhi macem-macem struktur sitoskeletal.
Karakterisasi asam urbenonat sing luwih rinci bakal mbantu luwih ngerti mekanisme kerja asam urbenonat. Utamane, tujuan sabanjure yaiku kanggo ngevaluasi kemampuan asam ursonat kanggo kaiket karo mikrotubulus sing direduksi kanggo nemtokake manawa asam ursonat lan turunane tumindak langsung ing mikrotubulus lan depolimerisasi, utawa apa tumindake nyebabake destabilisasi mikrotubulus. Kajaba iku, ing kasus ing ngendi mikrotubulus dudu target langsung, ngenali situs aksi lan target molekuler asam ursonat ing sel tanduran bakal mbantu luwih ngerti sifat senyawa sing gegandhengan lan cara sing bisa ditindakake kanggo nambah aktivitas herbisida. Uji bioaktivitas kita nuduhake kemampuan sitotoksik unik asam ursonat ing pertumbuhan tanduran kayata Arabidopsis thaliana, tembakau lan lumut ati, dene sel E. coli utawa HeLa ora kena pengaruh. Keracunan sithik utawa ora ana ing sel kewan minangka kauntungan saka turunan asam ursonat yen dikembangake minangka herbisida kanggo digunakake ing lapangan pertanian terbuka. Pancen, amarga mikrotubulus minangka struktur umum ing eukariota, inhibisi selektif ing tanduran minangka syarat utama kanggo herbisida. Contone, propyzamide, agen depolimerisasi mikrotubulus sing langsung kaiket karo tubulin lan nyegah polimerisasi, digunakake minangka herbisida amarga keracunan sing kurang kanggo sel kewan24. Beda karo disopyramide, benzamida sing gegandhengan duwe spesifisitas target sing beda. Saliyane mikrotubulus tanduran, RH-4032 utawa benzoxamide uga nyegah mikrotubulus sel kewan utawa oomycetes, lan zalilamide digunakake minangka fungisida amarga fitotoksisitas sing kurang25,26,27. Beruang sing nembe ditemokake lan turunane nuduhake sitotoksisitas selektif marang tanduran, nanging perlu dicathet yen modifikasi luwih lanjut bisa ngowahi spesifisitas target, kanthi potensial nyedhiyakake turunan tambahan kanggo ngontrol jamur patogen utawa oomycetes.
Sifat unik asam urbenonat lan turunane migunani kanggo pangembangane minangka herbisida lan digunakake minangka alat riset. Pentinge sitoskeleton ing ngontrol bentuk sel tanduran wis diakoni sacara wiyar. Panliten sadurunge nuduhake yen tanduran wis ngembangake mekanisme kompleks organisasi mikrotubulus kortikal kanthi ngontrol dinamika mikrotubulus kanggo ngontrol morfogenesis kanthi bener. Sejumlah gedhe molekul sing tanggung jawab kanggo regulasi aktivitas mikrotubulus wis diidentifikasi, lan riset sing gegandhengan isih ditindakake3,4,28. Pangerten kita saiki babagan dinamika mikrotubulus ing sel tanduran ora nerangake kanthi lengkap mekanisme organisasi mikrotubulus kortikal. Contone, sanajan disopiramid lan oryzalin bisa depolimerisasi mikrotubulus, disopiramid nyebabake distorsi oyot sing parah dene oryzalin duwe efek sing relatif entheng. Kajaba iku, mutasi ing tubulin, sing nyetabilake mikrotubulus, uga nyebabake dekstrorotasi ing oyot, dene paclitaxel, sing uga nyetabilake dinamika mikrotubulus, ora. Mulane, sinau lan ngenali target molekuler asam ursolat kudu menehi wawasan anyar babagan regulasi mikrotubulus kortikal tanduran. Semono uga, perbandingan bahan kimia ing mangsa ngarep sing efektif kanggo ningkatake pertumbuhan sing ora teratur, kayata disopiramid, lan bahan kimia sing kurang efektif, kayata oryzalin utawa asam kumamotorik, bakal menehi pitunjuk babagan kepiye pertumbuhan sing ora teratur kedadeyan.
Ing sisih liya, penyusunan ulang sitoskeletal sing ana gandhengane karo pertahanan minangka kemungkinan liyane kanggo nerangake sitotoksisitas asam ursonat. Infeksi patogen utawa introduksi elisitor menyang sel tanduran kadhangkala nyebabake karusakan sitoskeleton lan pati sel sabanjure29. Contone, cryptoxanthin sing asale saka oomycete wis dilaporake ngganggu mikrotubulus lan filamen aktin sadurunge pati sel rokok, padha karo sing kedadeyan karo perawatan KAND30,31. Kamiripan antarane respon pertahanan lan respon seluler sing disebabake dening asam ursonat ndadekake kita duwe hipotesis yen dheweke micu proses seluler umum, sanajan efek asam ursonat sing luwih cepet lan luwih kuat tinimbang cryptoxanthin katon. Nanging, panliten nuduhake yen gangguan filamen aktin ningkatake pati sel spontan, sing ora mesthi diiringi gangguan mikrotubulus29. Kajaba iku, isih kudu dideleng apa patogen utawa elisitor nyebabake pertumbuhan oyot sing kleru, kaya turunan asam ursonat. Dadi, kawruh molekuler sing ngubungake respon pertahanan lan sitoskeleton minangka masalah sing menarik kanggo ditangani. Kanthi ngeksploitasi anané senyawa bobot molekul rendah sing ana gandhengane karo asam ursonat, uga macem-macem turunan kanthi macem-macem potensi, senyawa kasebut bisa menehi kesempatan kanggo nargetake mekanisme seluler sing ora dingerteni.
Digabungake, panemuan lan aplikasi senyawa anyar sing ngowahi dinamika mikrotubulus bakal nyedhiyakake metode sing kuat kanggo ngatasi mekanisme molekuler kompleks sing ndasari penentuan bentuk sel tanduran. Ing konteks iki, senyawa asam urmotonat sing nembe dikembangake, sing mengaruhi mikrotubulus lan filamen aktin lan nyebabake pati sel, bisa menehi kesempatan kanggo nguraikan hubungan antarane kontrol mikrotubulus lan mekanisme liyane kasebut. Mangkono, analisis kimia lan biologis nggunakake asam urbenonat bakal mbantu kita ngerti mekanisme pengaturan molekuler sing ngontrol sitoskeleton tanduran.
Inokulasi S. werraensis MK493-CF1 menyang labu Erlenmeyer 500 mL sing wis di-baffle sing isine 110 mL medium wiji sing kasusun saka 2% (w/v) galaktosa, 2% (w/v) pasta esensi, 1% (w/v) komposisi Bacto.-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) ekstrak jagung (KOGOSTCH Co., Ltd., Jepang), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 lan 0,2% CaCO3 ing banyu deionisasi. (pH 7,4 sadurunge sterilisasi). Kultur wiji diinkubasi ing shaker rotary (180 rpm) ing suhu 27°C sajrone 2 dina. Budidaya produksi liwat fermentasi solid state. Kultur wiji (7 ml) dipindhah menyang labu K-1 500 ml sing ngemot 40 g medium produksi sing kasusun saka 15 g barley sing dipencet (MUSO Co., Ltd., Jepang) lan 25 g banyu deionisasi (pH ora diatur sadurunge sterilisasi). Fermentasi ditindakake ing suhu 30°C ing peteng sajrone 14 dina. Bahan fermentasi diekstrak nganggo 40 ml/botol EtOH lan disentrifugasi (1500 g, 4°C, 10 menit). Supernatan kultur (60 ml) diekstrak nganggo campuran 10% MeOH/EtOAc. Lapisan organik diuapké ing tekanan sing dikurangi kanggo éntuk residu (59,5 mg), sing diekskresi nganggo HPLC nganggo elusi gradien (0–10 menit: 90%) ing kolom fase terbalik (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × dawa 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 menit: 90% H2O/CH3CN nganti 70% H2O/CH3CN (gradien), 35–45 menit: 90% H2O/EtOH, 45–155 menit: 90% H2O/EtOH nganti 100% EtOH (gradien (gradien), 155–200 menit: 100% EtOH) kanthi laju aliran 1,5 ml/menit, kumamonamide (1, 36,0 mg) diisolasi minangka bubuk amorf putih.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nilai sing diitung: 141.0659, nilai sing diukur: 141.0663, IR νmaks 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Wiji Columbia (Col-0) dijupuk saka Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) kanthi ijin kanggo panggunaan riset. Wiji Col-0 disebarake lan dijaga miturut kahanan laboratorium lan digunakake minangka tanduran Arabidopsis tipe liar. Wiji Arabidopsis disterilisasi permukaan lan dibudidayakake ing medium Murashige lan Skoog setengah kekuatan sing ngemot 2% sukrosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morpholino)etanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) lan 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, ing suhu 23 °C lan cahya konstan. Wiji mutan phs1-1 diwenehake dening T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Wiji galur SR-1 disedhiyakake dening T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) lan digunakake minangka tanduran tembakau tipe liar. Wiji tembakau disterilisasi permukaan lan direndhem ing banyu steril sajrone telung wengi kanggo ningkatake perkecambahan, banjur dilebokake ing larutan setengah kekuatan sing ngemot sukrosa 2%, 0,05% (w/v) MES, lan 0,8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. lan medium Skoog) kanthi pH 5,7 lan diinkubasi ing suhu 23°C ing sangisore cahya sing tetep.
Galur Tak-1 disedhiyakake dening T. Kohchi (Universitas Kyoto) lan digunakake minangka unit eksperimen standar kanggo panliten lumut ati. Gemma dijupuk saka tanduran budidaya sing disterilisasi banjur dilapisi ing medium Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) sing ngemot 1% sukrosa lan 0,3% gellan gum lan diinkubasi ing suhu 23°C ing sangisore cahya terus-terusan.
Sel BY-2 tembakau (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) diwenehake dening S. Hasezawa (Universitas Tokyo). Sel BY-2 diencerake 95 kali lipat ing medium Linsmeier lan Skoog sing dimodifikasi lan ditambah saben minggu nganggo asam 2,4-diklorophenoxyacetic 32. Suspensi sel dicampur ing shaker rotary kanthi kecepatan 130 rpm ing suhu 27°C ing peteng. Cuci sel nganggo volume medium seger kaping 10 lan suspensi maneh ing medium sing padha. Garis sel transgenik BY-2 sing kanthi stabil ngekspresikan penanda mikrotubulus TagRFP-TUA6 utawa penanda filamen aktin GFP-ABD2 ing sangisore promotor virus mosaik kembang kol 35S digawe kaya sing diterangake 33,34,35. Garis sel iki bisa dijaga lan disinkronake nggunakake prosedur sing padha karo sing digunakake kanggo garis sel BY-2 asli.
Sel HeLa dikultur ing medium Dulbecco's modified Eagle's (DMEM) (Life Technologies) sing ditambah karo 10% serum janin sapi, 1,2 U/ml penisilin, lan 1,2 μg/ml streptomisin ing inkubator 37°C nganggo 5% CO2.
Kabeh eksperimen sing diterangake ing manuskrip iki ditindakake miturut peraturan lan pedoman biosafety Jepang.
Senyawa-senyawa kasebut dilarutake ing dimetil sulfoksida (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) minangka larutan stok lan diencerake ing medium MS kanggo Arabidopsis lan medium tembakau utawa Gamborg B5 kanggo lumut ati. Kanggo uji inhibisi pertumbuhan oyot, luwih saka 10 wiji saben piring disebar ing medium agar sing ngemot senyawa sing dituduhake utawa DMSO. Wiji diinkubasi ing ruang pertumbuhan sajrone 7 dina. Bibit difoto lan dawa oyot diukur. Kanggo uji perkecambahan Arabidopsis, 48 wiji saben piring disebar ing medium agar sing ngemot senyawa 200 μM utawa DMSO. Wiji Arabidopsis ditandur ing ruang pertumbuhan lan jumlah bibit sing berkecambah diitung 7 dina sawise perkecambahan (dag). Kanggo uji perkecambahan tembakau, 24 wiji saben piring disebar ing medium agar sing ngemot 200 μM KAND utawa DMSO. Wiji tembakau ditandur ing ruang pertumbuhan lan jumlah bibit sing berkecambah diitung sawise 14 dina. Kanggo uji inhibisi pertumbuhan lumut ati, 9 embrio saka saben piring dilebokake ing medium agar sing ngemot konsentrasi KAND utawa DMSO sing dituduhake lan diinkubasi ing ruang pertumbuhan sajrone 14 dina.
Gunakna tunas sing diwernani nganggo propidium iodida (PI) 5 mg/ml kanggo ndeleng organisasi meristem oyot. Sinyal PI diamati nganggo mikroskop fluoresensi nggunakake mikroskop pemindaian laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Pewarnaan histokimia oyot nganggo β-glucuronidase (GUS) ditindakake miturut protokol sing diterangake dening Malami lan Benfey36. Bibit difiksasi ing 90% aseton sewengi, diwernani nganggo 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-asam glukuronat ing buffer GUS sajrone 1 jam lan dilebokake ing larutan kloraldehida terhidrasi. (8 g kloral hidrat, 2 ml banyu lan 1 ml gliserol) lan diamati nganggo mikroskop kontras interferensi diferensial nggunakake mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Sudut oyot diukur ing tunas umur 7 dina sing ditandur ing piring sing dipasang kanthi vertikal. Ukur sudut oyot saka arah vektor gravitasi kaya sing diterangake ing langkah 6.
Susunan mikrotubulus kortikal diamati kaya sing diterangake, kanthi modifikasi cilik ing protokol 37. Antibodi anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) lan Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) digunakake minangka antibodi primer lan sekunder kanthi pengenceran 1:1000 lan 1:100. Gambar fluoresensi dipikolehi nggunakake mikroskop pemindaian laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Entuk gambar Z-stack lan gawe proyeksi intensitas maksimum miturut pandhuan pabrikan.
Uji proliferasi sel HeLa ditindakake nggunakake Cell Counting Kit 8 (Dojindo) miturut pandhuan saka pabrikan.
Pertumbuhan E. coli DH5α dianalisis kanthi ngukur kapadhetan sel ing kultur nggunakake spektrofotometer ing 600 nm (OD600).
Organisasi sitoskeletal ing sel BY-2 transgenik diamati nggunakake mikroskop fluoresensi sing dilengkapi piranti pemindaian confocal CSU-X1 (Yokogawa) lan kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Kapadhetan sitoskeletal ditaksir kanthi analisis gambar, sing ngetung persentase piksel sitoskeletal ing antarane piksel sitoplasma ing gambar confocal nggunakake piranti lunak ImageJ kaya sing diterangake38,39.
Kanggo ndeteksi pati sel ing sel BY-2, alikuot suspensi sel diinkubasi karo biru Evans 0,05% sajrone 10 menit ing suhu kamar. Pewarnaan biru Evans selektif saka sel mati gumantung saka ekstrusi pewarna saka sel sing urip dening membran plasma sing utuh40. Sel sing diwarnai diamati nggunakake mikroskop medan padhang (BX53, Olympus).
Sel HeLa ditumbuhake ing DMEM sing ditambah karo 10% FBS ing inkubator sing dilembabkan ing suhu 37°C lan 5% CO2. Sel kasebut diobati nganggo 100 μM KAND 11, asam kumamonamat 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), utawa 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) sajrone 6 jam ing suhu 37°C. Sel kasebut difiksasi nganggo MetOH sajrone 10 menit banjur nganggo asetat sajrone 5 menit ing suhu kamar. Sel sing difiksasi diinkubasi nganggo antibodi primer β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) sing diencerake ing 0,5% BSA/PBS sajrone 2 jam, dicuci kaping 3 nganggo TBST, banjur diinkubasi nganggo antibodi wedhus Alexa Fluor. 488 1 jam. – IgG tikus (Thermo Fisher Scientific: A11001) lan 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) sing diencerake ing 0,5% BSA/PBS. Sawise dikumbah nganggo TBST kaping telu, sel sing diwernani diamati ing mikroskop Nikon Eclipse Ti-E sing dibalik. Gambar dijupuk nganggo kamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 sing wis adhem nggunakake piranti lunak MetaMorph (Molecular Devices).
Wektu kiriman: 17 Juni 2024